Sectie Mammary Gland Whole Mounts voor Lesion Identificatie
Summary
We ontwikkelden een methode om succesvol te verwijderen, verwerken, delen en vlek voor histopathologische evaluatie, mammariumweefsel dat oorspronkelijk op glijbanen was vastgezet als gehele mounts. Deze methode kan de verzameling en evaluatie van de hele membraan van de borstklier bevorderen in onderzoeken voor reproductieve en ontwikkelingstest.
Abstract
De normale ontwikkeling van de borstklier kan worden veranderd door blootstelling aan milieuspecifieke stoffen en farmaceutische producten, overmatige blootstelling aan hormonen en genetische veranderingen. Mammary gland complete mounts zijn een goedkope methode om de voortgang van morfologische veranderingen vast te stellen die na blootstelling kunnen ontstaan. Echter, in het latere leven, wanneer abnormaliteiten meer geneigd zijn om te ontwikkelen, kan alleen vertrouwen op deze methode niet altijd voldoende informatie verschaffen om een goede diagnose van de abnormaliteit te maken. Historisch, in chemische test richtlijnen studies, wordt een enkele mammierklier bij necropsy verwijderd en bereid als een hematoxyline en eosine (H & E) -verfde sectie. De incorporation van contralaterale mammary full-mount collectie en analyse vermindert de kans op een valse negatieve beoordeling. Evaluatie van de gehele berg wordt beperkt door de aanwezigheid van één of twee hele borstklippen op een dia, en in sommige gevallen zijn de abnormaliteiten waargenomen in de gehele berg, geenT uniform vertegenwoordigd in de H & E sectie. Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een protocol voor het omzetten van de gehele membraan in de mantel naar H & E-gekleurde secties, zodat letsels die anders gemist of moeilijk te diagnosticeren kunnen worden geïdentificeerd. Hier worden we een methode beschreven om een hoogwaardige, paraffine-ingebedde H & E-sectie van een membraan te produceren die oorspronkelijk als een hele berg werd voorbereid. In vergelijking met een weefsel dat opzettelijk was voorbereid voor H & E sectie, vereist de hele berg extra voorbereiding op het verwijderen en verwerken van weefsels. Deze methode wordt echter beschouwd als goedkoop, aangezien het gebruikelijke laboratoriumreagentia en kleine extra tijd nodig heeft. Als resultaat kan deze methode onschatbare informatie verstrekken over hoe chemische en milieublootstelling de normale ontwikkeling van de borst verandert, evenals veranderingen die optreden als gevolg van genetische wijzigingen weergeven.
Introduction
De mammary whole mountis is een nuttige en goedkope methode geïmplementeerd in veel ratten- en muisstudies om zowel normale als chemisch geïnduceerde, abnormale ontwikkeling te begrijpen. In het algemeen zal een membraan die op verschillende stadia wordt verzameld tijdens het ontwikkelen van knaagdieren (dat wil zeggen adolescentie, puberteit, midden- tot late-zwangerschap en invasiefase) morfologische veranderingen in weefsel- en cellulaire architectuur beïnvloeden, beïnvloed door paracrine, endocriene en autocrine factoren 1 . In de verouderende rat worden de epitheliale en stromale delen van de klier steeds dichter, waardoor de morfologische parameters van meetinstrumenten moeilijk in een gehele berging moeilijk zijn. Zo is het gebruikelijk om een klier te verzamelen voor histologische evaluatie om veranderingen op microscopisch niveau te identificeren. Beide processen zijn vooral nuttig in studies waarbij chemische blootstelling (dat wil zeggen milieu- of farmaceutisch) of de morfologische veranderingen die vergezeld gaan van genetische alterna- tuuraties.
Technieken en mogelijkheden voor het gebruik van de borstklier bij risico-evaluatie blijven evolueren. Terwijl de volledige montage voorbereiding routine en gestandaardiseerd is, blijven wijzigingen in sectie 2 , 3 . Vele onderzoeksgroepen met verschillende achtergronden (dwz, universiteiten, overheid en bedrijfsleven) hebben coronale / langsdoorsneden van borstweefsel als voorkeursmethode ingericht, terwijl sommige laboratoria nog kopse gedeeltes heeft door de huid 4. De laatste methode resulteert in een buitensporige weergave van de epidermis (huid), in plaats van het weefsel van belang: het membraanepitheel 2 . Coronale of longitudinale secties zijn nuttiger om het normale weefsel 5 te karakteriseren en de detectie van abnormaliteiten en letsels sterk te verbeteren door het verhoogde oppervlak en het aantal aanwezige structuren. Over het algemeen maakt dit de hele maGeen geschikte methode voor de vergelijkende histopathologische beoordeling van de borstklier 1 , 2 . Of het nu gaat met behulp van een muis of een rat, retrieval, en het behoud van de 4 e en 5 e liesklieren wordt ten zeerste aanbevolen voor de vergelijking van het geheel te monteren op een contralaterale H & E sectie.
Bij gebruik in combinatie, geven de H & E sectie en de volledige mount een nauwkeurig overzicht van de cellulaire en morfologische veranderingen die door blootstelling aan het milieu worden veroorzaakt. Dit is vooral waar bij bepaalde knaagdierstammen waarin het model een lage vatbaarheid heeft voor tumorvorming of een tumor niet grof zichtbaar is. In sommige gevallen kan het verkrijgen van het benodigde weefsel niet altijd mogelijk zijn met beide technieken ( dwz onvoldoende weefselhoeveelheid, middelen of onverwachte experimentele resultaten). In ons geval werden abnormaliteiten waargenomen in de volledige berghok, terwijl histopathoLogische bevindingen in de contralaterale H & E klier waren meestal normaal. De overweldigende discrepantie tussen de contralaterale klieren leidde ons tot een economische en efficiënte procedure om de abnormaliteiten in de gehele mounts te identificeren. Met behulp van een gewijzigde verwerkings- en embedingsprocedure werden hoogwaardige H & E-gekleurde secties bereid uit paraffine-ingebedde gehele montages. We beschouwen dit protocol als een krachtig detectiemiddel voor chemische blootstellingseffecten, waardoor inter-lab vergelijkingen worden verbeterd.
Protocol
Representative Results
Discussion
De volledige membraan van de borstklier is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de normale ontwikkeling van de borstvoeding en morfologische veranderingen te illustreren die kunnen optreden en voortzetten na blootstelling aan chemicaliën, waaronder endocriene verstoringen. Wanneer een hele berg- en H & E-sectie van hetzelfde dier samen worden beoordeeld, kunnen ze een nauwkeurige visuele snapshot van vroege veranderingen verschaffen, die in een ziekere toestand kunnen komen.
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zouden Pam Ovwigho, Tenette Jones en Natasha Clayton, NIEHS, willen erkennen voor hun technische expertise en ondersteuning bij dit project.
Materials
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
References
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).
- Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. , (2017).
- Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).
- Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).
- Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).
- Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).
- Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).
