Sezione delle ghiandole mammarie per tutti gli attacchi per identificazione delle lesioni
Summary
Abbiamo sviluppato un metodo per eliminare, elaborare, tagliare e colorare con successo, per la valutazione istopatologica, il tessuto mammario che era stato originariamente fissato su diapositive come supporti interi. Questo metodo può promuovere la raccolta e la valutazione dei supporti integrali delle ghiandole mammarie negli studi di orientamento test riproduttivo e di sviluppo.
Abstract
Lo sviluppo della ghiandola mammaria normale può essere alterato dall'esposizione a tossiche ambientali e ai prodotti farmaceutici, esposizione eccessiva agli ormoni e alterazioni genetiche. I supporti interiori della ghiandola mammaria sono un metodo poco costoso per catturare la progressione dei cambiamenti morfologici che possono sorgere dopo l'esposizione. Tuttavia, nella vita successiva, quando le anomalie sono più inclini a svilupparsi, la sola dipendenza da questo metodo può non fornire sempre informazioni sufficienti per fare una corretta diagnosi dell'anomalia. Storicamente, negli studi di orientamento chimico della prova, una singola ghiandola mammaria viene rimossa in necrosi e preparata come una sezione ematossilina e eosina (H & E). L'incorporazione della raccolta e dell'analisi contralaterale di mammiferi integrali diminuisce la probabilità di una valutazione falsa-negativa. La valutazione dell'intero supporto è limitata dalla presenza di una o due intere ghiandole mammarie su uno scivolo e in alcuni casi le anomalie osservate nell'intero supporto non sonoT uniformemente rappresentato nella sezione H & E. L'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un protocollo per la conversione di supporti interni di mammary coperti in H & E, in modo che le lesioni che altrimenti sarebbero state perdute o che sono difficili da diagnosticare possono essere identificate. Qui, abbiamo dettagliato un metodo per produrre una sezione H & E di alta qualità incorporata in paraffina da una ghiandola mammaria inizialmente preparata come supporto intero. In confronto ad un tessuto che è stato intenzionalmente preparato per la sezione H & E, l'intero supporto richiede ulteriori preparazioni per la rimozione e l'elaborazione dei tessuti. Tuttavia, questo metodo è considerato poco costoso, in quanto richiede comuni reagenti di laboratorio e poco tempo supplementare. Di conseguenza, questo metodo può fornire informazioni preziose su come le esposizioni chimiche e ambientali alterano il normale sviluppo mammario, oltre a visualizzare le modifiche che si verificano a causa di modifiche genetiche.
Introduction
Il montascale mammario è un metodo utile e poco costoso, realizzato in molti studi su ratti e mouse, per comprendere sia lo sviluppo anomalo normale che chimico-indotto. In generale, una ghiandola mammaria raccolte a vari stadi durante lo sviluppo roditore (cioè, l'adolescenza, pubertà, metà a fine gestazione, e la fase di involuzione) mostrerà cambiamenti morfologici nel tessuto e architettura cellulare influenzato da paracrino, endocrini, e fattori autocrini 1 . Nel ratto di invecchiamento, le porzioni epiteliali e stromali della ghiandola diventano sempre più densi, rendendo difficili i parametri morfologici di misura in un intero monte. Quindi, è pratica comune raccogliere una ghiandola per la valutazione istologica per identificare i cambiamenti a livello microscopico. Entrambi i processi sono particolarmente utili in studi che implicano esposizione chimica ( cioè ambientale o farmaceutica) o per esaminare i cambiamenti morfologici accompagnati da alterazioni genetichezioni.
Le tecniche e le capacità di utilizzare la ghiandola mammaria nella valutazione del rischio continuano ad evolversi. Mentre la preparazione a tutto montaggio è routine e standardizzata, le modifiche alla sezione continuano 2 , 3 . Molti gruppi di ricerca di diversi ambiti (ad esempio, università, governo e industria) hanno adattato le sezioni coronali / longitudinali del tessuto mammario come un metodo preferito, mentre alcuni laboratori utilizzano ancora sezioni trasversali attraverso la pelle 4 . Quest'ultimo metodo produce un'incredibile rappresentazione dell'epidermide (pelle), anziché del tessuto di interesse: l'epitelio della ghiandola mammaria 2 . Le sezioni coronali o longitudinali sono più utili per caratterizzare il tessuto normale 5 e migliorare notevolmente la rilevazione di anomalie e lesioni dovute all'aumento della superficie e al numero di strutture presenti. Nel complesso, questo rende tutto il moUn metodo adeguato per la valutazione comparativa istopatologica della ghiandola mammaria 1 , 2 . Sia che si utilizzi un topo o un ratto, il recupero e conservazione del 4 ° e 5 ° ghiandole inguinali è altamente raccomandato per il confronto di tutta montare una sezione controlaterale H & E.
Se utilizzati in combinazione, la sezione H & E e l'intero supporto forniscono un accurato esame dei cambiamenti cellulari e morfologici indotti dall'esposizione ambientale. Ciò è particolarmente vero in alcuni ceppi di roditori in cui il modello possiede una bassa suscettibilità alla formazione del tumore o un tumore non è grossolanamente visibile. In alcune circostanze, l'ottenimento del tessuto richiesto può non essere sempre possibile utilizzando entrambe le tecniche ( ossia quantità insufficiente di tessuti, risorse o risultati sperimentali inaspettati). Nel nostro caso, anomalie sono state osservate nel montante intero mammario, mentre istopatoI risultati logici nella ghiandola H & E contralaterale erano per lo più normali. La divergenza enorme tra le ghiandole contralaterali ci ha portati a sviluppare una procedura economica ed efficiente per individuare le anomalie in tutti i montanti. Utilizzando una procedura di trasformazione e di incorporazione modificata, le sezioni trattate con H & E di alta qualità sono state preparate da supporti interamente incorporati in paraffina. Immaginiamo che questo protocollo diventi uno strumento di rilevazione potente per gli effetti di esposizione chimica, migliorando i confronti tra laboratori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il supporto integrale della ghiandola mammaria è un potente strumento che può essere utilizzato per illustrare lo sviluppo normale del mammifero e le alterazioni morfologiche che possono sorgere e persistono dopo l'esposizione a sostanze chimiche, inclusi i disgregatori endocrini. Quando un insieme completo e la sezione H & E dello stesso animale vengono valutati insieme, possono fornire un'istantanea precisa di alterazioni precoci, che possono avanzare in uno stato più malato.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere Pam Ovwigho, Tenette Jones e Natasha Clayton, NIEHS, per la loro esperienza tecnica e supporto con questo progetto.
Materials
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
References
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).
- Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. , (2017).
- Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).
- Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).
- Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).
- Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).
- Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).
