Seccionando los Montes Enteros de las Glándulas Mamarias para la Identificación de Lesiones
Summary
Desarrollamos un método para eliminar, procesar, seccionar y teñir exitosamente, para la evaluación histopatológica, el tejido mamario que originalmente había sido fijado en diapositivas como monturas enteras. Este método puede promover la recolección y evaluación de monturas enteras de glándulas mamarias en estudios de referencia de pruebas reproductivas y de desarrollo.
Abstract
El desarrollo normal de las glándulas mamarias puede verse alterado por la exposición a tóxicos ambientales y productos farmacéuticos, exposición excesiva a hormonas y alteraciones genéticas. Las guarniciones enteras de la glándula mamaria son un método barato para capturar la progresión de los cambios morfológicos que pueden surgir después de la exposición. Sin embargo, en la vida posterior, cuando las anomalías son más propensas a desarrollarse, la única dependencia de este método puede no siempre proporcionar información suficiente para hacer un diagnóstico adecuado de la anomalía. Históricamente, en los estudios de guía de pruebas químicas, una única glándula mamaria se elimina en la necropsia y se prepara como hematoxilina y eosina (H & E) -stained sección. La incorporación de la recolección y análisis de todo el montaje mamario contralateral disminuye la probabilidad de una evaluación falso-negativa. La evaluación de la totalidad del soporte está limitada por la presencia de una o dos glándulas mamarias enteras en una diapositiva y, en algunos casos, las anomalías observadas en todo el soporte no sonT uniformemente representada en la sección H & E. El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo para la conversión de coverslipped mamífero entero monta a H & E manchado secciones de modo que las lesiones que de lo contrario se han perdido o que son difíciles de diagnosticar se puede identificar. Aquí se detalla un método para producir una sección H & E embebida en parafina de alta calidad de una glándula mamaria que se preparó inicialmente como una montura completa. En comparación con un tejido que se preparó intencionalmente para la sección de H & E, todo el soporte requiere una preparación adicional para la eliminación y procesamiento del tejido. Sin embargo, este método se considera barato, ya que requiere reactivos de laboratorio comunes y poco tiempo adicional. Como resultado, este método puede proporcionar información invaluable sobre cómo las exposiciones químicas y ambientales alteran el desarrollo mamario normal, así como mostrar los cambios que se producen debido a las modificaciones genéticas.
Introduction
La madre entera mamaria es un método útil y barato implementado en muchos estudios de ratas y ratones para comprender tanto el desarrollo anormal normal como químicamente inducido. En general, una glándula mamaria recogida en diferentes etapas durante el desarrollo de los roedores ( es decir, la adolescencia, la pubertad, la mitad de la gestación tardía y la fase de involución) mostrará cambios morfológicos en los tejidos y la arquitectura celular influenciada por factores parácrinos, endocrinos y autócrinos 1 . En la rata envejecida, las porciones epitelial y estromal de la glándula se vuelven cada vez más densas, lo que dificulta la medición de los parámetros morfológicos en un montaje completo. Por lo tanto, es una práctica común para recoger una glándula para la evaluación histológica para identificar los cambios en un nivel microscópico. Ambos procesos son especialmente útiles en estudios que involucran exposición química ( es decir, ambiental o farmacéutica) o para examinar los cambios morfológicos acompañados de alteraciones genéticasAciones.
Las técnicas y capacidades para el uso de la glándula mamaria en la evaluación del riesgo continúan evolucionando. Mientras que la preparación de todo el montaje es rutinaria y estandarizada, las modificaciones al seccionamiento continúan 2 , 3 . Muchos grupos de investigación de diversos orígenes ( es decir, la academia, el gobierno y la industria) han adaptado las secciones coronales y longitudinales del tejido mamario como método preferido, mientras que algunos laboratorios siguen utilizando secciones transversales a través de la piel 4 . Este último método da como resultado una representación desordenada de la epidermis (piel), en lugar del tejido de interés: el epitelio de la glándula mamaria 2 . Las secciones coronales o longitudinales son más útiles para caracterizar el tejido normal 5 y mejoran en gran medida la detección de anomalías y lesiones debido al aumento del área superficial y el número de estructuras presentes. En general, esto hace que la moSin un método adecuado para la evaluación histopatológica comparativa de la glándula mamaria 1 , 2 . Si se utiliza un ratón o una rata, la recuperación y la preservación de las glándulas inguinales 4ª y 5ª es altamente recomendada para la comparación de todo el soporte con una sección contralateral de H & E.
Cuando se usan en combinación, la sección de H & E y el montaje completo proporcionan una descripción precisa de los cambios celulares y morfológicos inducidos por la exposición ambiental. Esto es especialmente cierto en ciertas cepas de roedores en las que el modelo posee una baja susceptibilidad a la formación de tumores o un tumor no es claramente visible. En algunas circunstancias, la obtención del tejido requerido no siempre es posible utilizando ambas técnicas ( es decir, cantidad de tejido insuficiente, recursos o resultados experimentales inesperados). En nuestro caso, se observaron anomalías en el montaje completo mamario, mientras que histopathoLos hallazgos lógicos en la glándula contralateral H & E eran en su mayoría normales. La abrumadora discrepancia entre las glándulas contralaterales nos llevó a desarrollar un procedimiento económico y eficiente para identificar las anomalías en los montajes en su conjunto. Utilizando un proceso de procesamiento y empotramiento modificado, se prepararon secciones de alta calidad H & E-manchadas de soportes enteros parafina-embebidos. Prevemos que este protocolo se convierta en una potente herramienta de detección de efectos de exposición química, mejorando las comparaciones entre laboratorios.
Protocol
Representative Results
Discussion
El montaje completo de la glándula mamaria es una poderosa herramienta que puede usarse para ilustrar el desarrollo mamario normal y las alteraciones morfológicas que pueden surgir y persistir después de la exposición a químicos, incluyendo los disruptores endocrinos. Cuando se evalúan conjuntamente un conjunto completo y una sección de H & E del mismo animal, pueden proporcionar una instantánea visual precisa de las primeras alteraciones, que pueden progresar hacia un estado más enfermo.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Pam Ovwigho, Tenette Jones y Natasha Clayton, NIEHS, por su experiencia técnica y apoyo con este proyecto.
Materials
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
References
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