Uitbreiding en Adipogenese Inductie van Adipocyt Progenitors van Perivasculaire Adipose Weefsel Geïsoleerd door Magnetische Geactiveerde Cell Sorting
Summary
Hier worden een methode beschreven voor het isoleren van Adipocyte Progenitor Cell (APC) populaties uit Perivascular Adipose Tissue (PVAT) met behulp van Magnetisch-geactiveerde Cell Sorting (MCS). Deze methode zorgt voor een verhoogde isolatie van APC per gram vetweefsel in vergelijking met Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS).
Abstract
Uitbreiding van Perivasculaire Adipose Tissue (PVAT), een belangrijke regulator van vasculaire functie door paracrine signalering, is direct gerelateerd aan de ontwikkeling van hypertensie tijdens obesitas. De omvang van hypertrofie en hyperplasie hangt af van de plaats van de depot, het geslacht, en het type van adipocyte progenitorcel (APC) fenotypes aanwezig. Technieken die zijn gebruikt voor APC en preadipocytenisolatie in de afgelopen 10 jaar, hebben de nauwkeurigheid verbeterd waardoor individuele cellen kunnen worden geïdentificeerd op basis van specifieke celoppervlakmarkers. Isolatie van APC en adipocyten kan echter een uitdaging zijn als gevolg van de fragiliteit van de cel, vooral als de intacte cel moet worden behouden voor celcultuurtoepassingen.
Magnetisch geactiveerde Cell Sorting ( MCS) verschaft een methode om een groter aantal levensvatbare APC per gewicht eenheid van vetweefsel te isoleren. APC geoogst door MCS kan worden gebruikt voor in vitro protocollen om prea uit te breidenDipocyten en onderscheiden ze in adipocyten door gebruik te maken van groeifactorcocktails die het mogelijk maken om te analyseren van het prolifische en adipogene potentieel dat door de cellen wordt bewaard. Dit experiment was gericht op de aorta en mesenterische PVAT depots, die een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van hart- en vaatziekten tijdens de expansie. Deze protocollen beschrijven methoden om een gedefinieerde populatie APC te isoleren, uit te breiden en te differentiëren. Dit MCS-protocol maakt het mogelijk om isolatie te gebruiken in elk experiment waarbij celsortering nodig is met minimale apparatuur of training. Deze technieken kunnen verdere experimenten helpen om de functionaliteit van specifieke celpopulaties te bepalen op basis van de aanwezigheid van celoppervlakmarkers.
Introduction
Perivasculaire Adipose Tissue (PVAT), vanwege de nabijheid van bloedvaten, is een belangrijke paracrine signalering component in vasculature functie 1 . Uitbreiding van dit vetweefsel is afhankelijk van het fenotype van de aanwezige 2 , 3 Adipocyte Progenitor Cells (APC). Isolatie van cellen uit vetweefsels is moeilijk aangezien primaire adipocyten fragiel, vloeibaar en omvangrijk zijn. Bepaalde isolatietechnieken kunnen ook het celfenotype en de morfologie veranderen door de inflammatoire eiwitsynthese te verhogen en de adipogene genuitdrukking 4 te verminderen , waarbij het belang van een protocol dat de integriteit van de cellen handhaaft, benadrukt.
Cultuur van primaire cellen en specifieke preadipocyt subpopulaties geeft een reductieve aanpak van in vivo groei en handhaaft equivalente cellulaire genetische make-up 5 , hoewel werkende tiIk met deze cellen is beperkt vanwege verslechtering met veroudering of senescentie 6 . Preadipocyten uit verschillende adipose depots, waaronder subcutane en omale depots, tonen ook verschillen in proliferatie 7 , die het belang benadrukken van het verzamelen van cellen uit specifieke anatomische plaatsen. Voorlopercellen van non-PVAT white adipose depots zijn gekenmerkt in eerdere studies 7 , 8 , 9 , maar minder is bekend over PVAT APC fenotypen.
De hier beschreven technieken maken het mogelijk om specifieke en gedefinieerde APC populaties te analyseren met een minimale impact op hun morfologie, levensvatbaarheid en potentieel om te prolifereren en te differentiëren. Magnetisch geactiveerde Cell Sorting (MCS) is vatbaar voor downstream toepassingen, zoals cultuur, als de kralen oplossen zonder de cel te veranderen. MCS is ook economisch, en zodra het antilichaam conCentraties zijn gestandaardiseerd, de behoefte aan flow cytometrie assays is minimaal. In vitro studies met PVAT precursoren kunnen ook een beeld geven van het potentieel dat deze primaire cellen kunnen hebben.
Protocol
Representative Results
Discussion
De centrale focus van het onderhavige experiment is de isolatie, expansie en adipogene inductie van APC van PVAT depots. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van APC op basis van de identificatie van cellen die de oppervlakte markers CD34 en PDGFRα uitdrukken. Deze oppervlakte-eiwitten werden eerder geïdentificeerd op APC met hoge proliferatiecijfers en het potentieel om te onderscheiden in witte of bruine adipocyten in verschillende adipose depots 14 , <sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De Contreras en Watts Laboratories en Dr. William Raphael. Deze experimenten werden ondersteund door NHLBI F31 HL128035-01 (weefselvertering protocol standaardisatie), NHLBI 5R01HL117847-02 en 2P01HL070687-11A1 (dieren) en NHLBI 5R01HL117847-02 (celisolatie en cultuur).
Materials
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| PBS 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48- Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. . in eLS. , (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
