Расширение и адипогенез Индукция адипоцитов-предшественников из периваскулярной жировой ткани, изолированной магнитоактивированной сортировкой клеток
Summary
Здесь мы сообщаем о способе выделения популяций клеток-предшественников Adipocyte (APC) из периваскулярной жировой ткани (PVAT) с использованием магнитно-активированной сортировки клеток (MCS). Этот метод позволяет увеличить выделение APC на грамм жировой ткани по сравнению с флуоресцентно-активированной сортировкой клеток (FACS).
Abstract
Расширение периваскулярной жировой ткани (PVAT), основного регулятора сосудистой функции через паракринную сигнализацию, напрямую связано с развитием гипертонии во время ожирения. Степень гипертрофии и гиперплазии зависит от местонахождения депо, пола и типа фенотипов клеток-предшественников адипоцитов (APC). Методы, используемые для изоляции APC и преадипоцитов за последние 10 лет, значительно повысили точность, с которой отдельные клетки могут быть идентифицированы на основе определенных маркеров поверхности клеток. Однако выделение APC и адипоцитов может быть проблемой из-за хрупкости клетки, особенно если интактная клетка должна быть сохранена для применений клеточной культуры.
Магнитно-активированная сортировка клеток ( MCS) обеспечивает метод выделения большего числа жизнеспособных APC на единицу веса жировой ткани. APC, собранный MCS, может использоваться для протоколов in vitro для расширения preaДипоциты и дифференцировать их в адипоциты с использованием коктейлей фактора роста, позволяющих анализировать плодовитый и адипогенный потенциал, сохраняемый клетками. Этот эксперимент был сосредоточен на аортальных и брыжеечных складах PVAT, которые играют ключевую роль в развитии сердечно-сосудистых заболеваний во время расширения. Эти протоколы описывают методы выделения, расширения и дифференциации определенной совокупности APC. Этот протокол MCS позволяет использовать изоляцию в любом эксперименте, в котором требуется сортировка ячейки с минимальным оборудованием или обучением. Эти методы могут помочь в дальнейших экспериментах для определения функциональности конкретных популяций клеток на основе присутствия маркеров клеточной поверхности.
Introduction
Периваскулярная жировая ткань (PVAT), из-за ее непосредственной близости к кровеносным сосудам, является основным сигнальным компонентом паракрина в функции сосудов. Расширение этой жировой ткани зависит от фенотипа клеток-предшественников Adipocyte (APC), присутствующих 2 , 3 . Выделение клеток из жировых тканей затруднено, поскольку первичные адипоциты являются хрупкими, плавучими и имеют размер. Некоторые методы изоляции также могут изменять фенотип и морфологию клеток путем увеличения синтеза воспалительных белков и уменьшения экспрессии адипогенного гена 4 , подчеркивая важность протокола, который поддерживает целостность клеток.
Культура первичных клеток и специфических субпопуляций преадипоцитов дает редукционистский подход к росту in vivo и поддерживает эквивалентный клеточный генетический состав 5 , хотя работа tiЯ с этими клетками ограничен из-за ухудшения со старением или старения 6 . Preadipocytes из различных жировых складов, в том числе подкожных и оментальных складов, также демонстрируют различия в пролиферации 7 , что подчеркивает важность сбора клеток из конкретных анатомических сайтов. Ячейки-предшественники из не-PVAT белых жировых депо были охарактеризованы в предыдущих исследованиях 7 , 8 , 9 , но меньше известно о фенотипах PVAT APC.
Описанные здесь методы позволяют анализировать конкретные и определенные популяции APC с минимальным воздействием на их морфологию, жизнеспособность и потенциал для пролиферации и дифференциации. Магнитоактивированная сортировка клеток (MCS) применима к нисходящим приложениям, таким как культура, поскольку шарики растворяются без изменения ячейки. MCS также является экономичным, и как только антитело conЦентровки были стандартизированы, потребность в анализе проточной цитометрии минимальна. Исследования in vitro с предшественниками PVAT также могут дать представление о потенциале, который могут иметь эти первичные клетки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Центральным направлением настоящего эксперимента является изоляция, расширение и адипогенная индукция APC из хранилищ PVAT. Здесь мы представляем протокол для выделения APC на основе идентификации клеток, экспрессирующих поверхностные маркеры CD34 и PDGFRα. Эти поверхностные белки были ране?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Лаборатории Контрераса и Ватта и доктора Уильяма Рафаэля. Эти эксперименты поддерживали NHLBI F31 HL128035-01 (стандартизация протокола пищеварения), NHLBI 5R01HL117847-02 и 2P01HL070687-11A1 (животные) и NHLBI 5R01HL117847-02 (выделение клеток и культура).
Materials
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| PBS 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48- Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. . in eLS. , (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
