자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도
Summary
여기에서는 MCS (Magnetic-activated Cell Sorting)를 사용하여 Perivascular Adipose Tissue (PVAT)에서 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cell, APC) 개체군을 분리하는 방법을보고합니다. 이 방법은 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)와 비교할 때 지방 조직 1g 당 APC의 증가 된 분리를 허용합니다.
Abstract
Paracrine 신호를 통한 혈관 기능의 주요 조절자인 Perivascular Adipose Tissue (PVAT)의 확장은 비만 동안 고혈압 발생과 직접적으로 관련이 있습니다. 비대 및 증식의 정도는 저장소 위치, 성별 및 존재하는 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cell, APC) 표현형의 유형에 달려 있습니다. 지난 10 년 동안 APC와 전 지방 세포 분리에 사용 된 기술은 특정 세포 표면 마커를 기반으로 개별 세포를 식별 할 수있는 정확성을 획기적으로 향상 시켰습니다. 그러나 APC와 지방 세포의 분리는 세포의 취약성으로 인해 어려움이 될 수 있습니다. 특히 손상되지 않은 세포가 세포 배양에 사용되어야하는 경우 특히 그렇습니다.
MCS (Magnetic-activated Cell Sorting )는 지방 조직의 무게 단위 당 더 많은 수의 APC를 분리하는 방법을 제공합니다. MCS에 의해 수확 된 APC 는 시험 관내 프로토콜에 사용되어 prea세포에 의해 유지되는 다작 및 지방 형성 잠재력의 분석을 허용하는 성장 인자 칵테일의 사용을 통해 지방 세포로 이들을 분화시킨다. 이 실험은 대동맥 및 장간막 PVAT 저장소에 초점을 두었습니다.이 저장소는 확장 중에 심혈관 질환 발병에서 중요한 역할을합니다. 이 프로토콜은 정의 된 APC 인구를 분리, 확장 및 차별화하는 방법을 설명합니다. 이 MCS 프로토콜을 사용하면 최소한의 장비 또는 교육으로 세포 정렬이 필요한 모든 실험에서 격리를 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 세포 표면 마커의 존재를 기반으로 특정 세포 인구의 기능을 결정하기 위해 추가 실험을 도울 수 있습니다.
Introduction
혈관과의 근접성 때문에 혈관 주위 지방 조직 (Perivascular Adipose Tissue, PVAT)은 혈관 기능 1 에서 중요한 파라 크린 신호 전달 요소입니다. 이 지방 조직의 팽창은 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cells, APC)의 표현형에 따라 다릅니다 2 , 3 . 지방 세포로부터의 분리는 주요 지방 세포가 약하고 부력이 있고 크기가 다양하기 때문에 어렵습니다. 특정 분리 기술은 또한 염증 단백질 합성을 증가시키고 지방 생성 유전자 발현을 감소시킴으로써 세포 표현형 및 형태를 변화시킬 수 있으며, 세포의 완전성을 유지하는 프로토콜의 중요성을 강조한다.
1 차 세포 및 특이적인 전 지방 세포 모집단의 배양 은 생체 내 성장 에 대한 환원 주의적 접근법을 제공하고, 동등한 세포 유전 학적 구성을 유지한다.이 세포들을 가지고있는 노화는 노화 또는 노화로 인한 악화로 인해 제한됩니다 6 . 피하 및 망막 저장소를 비롯한 다양한 지방 저장소의 전 지방 세포는 또한 특정 해부학 적 부위에서 세포를 수집하는 중요성을 강조하는 증식의 차이를 보여준다. 비 PVAT 백색 지방 저장소의 선구 세포는 이전 연구 7,8,9에서 특징 지어졌지만 PVAT APC 표현형에 대해서는 알려진 바가 적다.
여기에 설명 된 기술은 형태와 생존력, 증식 및 분화 가능성에 미치는 영향을 최소화하면서 특정 APC 집단과 정의 된 APC 집단을 분석 할 수 있습니다. MCS (Magnetic-Activated Cell Sorting)는 배양액과 같이 다운 스트림 응용 분야에 적합합니다. 구슬이 세포를 변경하지 않고 용해되기 때문입니다. MCS는 또한 경제적이며 일단 항체가 손상되면농도가 표준화 되었기 때문에 유동 세포 계측법의 필요성은 미미합니다. PVAT 선구 물질에 대한 시험 관내 연구는 또한 이러한 일차 세포가 가질 수있는 잠재력을 엿볼 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 실험의 중심은 PVAT 저장소에서 APC를 분리, 확장 및 지방 생성 유도하는 것입니다. 여기서 우리는 표면 마커 CD34 및 PDGFRα를 발현하는 세포의 동정에 기초한 APC의 분리 프로토콜을 제시한다. 이러한 표면 단백질은 이전 APC에서 높은 증식 속도와 다양한 지방 저장소 14 , 15 에서 흰색 또는 갈색 지방 세포로 분화 할 잠재력으로 확인되었습니다. 이러한…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Contreras와 Watts Laboratories와 William Raphael 박사. 이 실험은 NHLBI F31 HL128035-01 (조직 분해 프로토콜 표준화), NHLBI 5R01HL117847-02 및 2P01HL070687-11A1 (동물) 및 NHLBI 5R01HL117847-02 (세포 분리 및 배양)에 의해 지원되었다.
Materials
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| PBS 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48- Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
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