הרחבת אדיפוגנזה השראה של אבות אדיפוציטים מ רקמות אדיבוס perivascular מבודדים על ידי מיון מגנטי המופעל תא
Summary
כאן אנו מדווחים על שיטה לבידוד של אוכלוסיות תאי אב (APC) של אדיפוציטים (APC) מתוך רקמת אדיפוס (Perivascular Adipose Tissue) (PVAT) תוך שימוש במיון תאים מגנטיים המופעל (MCS). שיטה זו מאפשרת בידוד מוגבר של APC לכל גרם של רקמת השומן בהשוואה לפלואורסצנטי המופעל תא מיון (FACS).
Abstract
הרחבת רקמת אדיפוס (Perivascular Adipose Tissue) (PVAT), הרגולטור העיקרי של תפקוד כלי הדם באמצעות איתות paracrine, קשורה ישירות להתפתחות יתר לחץ דם במהלך השמנת יתר. היקף היפרטרופיה ו hyperplasia תלוי במיקום dot, מין, ואת סוג של פנויה epipocyte אב (APC) פנוטיפים הנוכחי. טכניקות המשמשות בידוד APC ו preadipocytes ב 10 השנים האחרונות שיפרו באופן דרסטי את הדיוק שבו תאים בודדים ניתן לזהות על בסיס סמנים ספציפיים משטח התא. עם זאת, בידוד של APC ו adipocytes יכול להיות אתגר בשל שבירות של התא, במיוחד אם התא שלם צריך להישמר עבור יישומי תרבות התא.
מגנטי המופעל תא מיון ( MCS) מספק שיטה של בידוד מספר גדול יותר של APC קיימא לכל יחידת משקל של רקמת השומן. APC שנקטפו על ידי MCS יכול לשמש פרוטוקולי חוץ גופית כדי להרחיב פרהDipocytes ולהבדיל אותם לתוך אדיפוציטים באמצעות שימוש בגורם גורם הגדילה המאפשר ניתוח של פוטנציאל פורה אדיפוגני שמרו על ידי התאים. ניסוי זה התמקד בתחנות ה- PVAT של אבי העורקים והמזנטרים, אשר ממלאים תפקידים מרכזיים בהתפתחות מחלות לב וכלי דם במהלך ההתפשטות. פרוטוקולים אלה מתארים שיטות לבודד, להרחיב ולהבדיל אוכלוסייה מוגדרת של APC. זה פרוטוקול MCS מאפשר בידוד לשמש בכל ניסוי שבו מיון התא נדרש עם ציוד מינימלי או הכשרה. טכניקות אלה יכולים לסייע ניסויים נוספים כדי לקבוע את הפונקציונליות של אוכלוסיות תאים ספציפיים בהתבסס על נוכחות של סמנים פני השטח התא.
Introduction
Perivascular רקמת אדיפוס (PVAT), בשל קרבתו לכלי הדם, הוא מרכיב מרכזי paracrine איתות ב תפקוד כלי הדם 1 . הרחבת רקמת השומן תלויה בפנוטיפ של תאי האב-אדפוציטים (APC) , 2 , 3 . בידוד של תאים ברקמות השומן קשה כמו adipocytes העיקרית הם שבירים, ציפה, ואת טווח בגודל. טכניקות בידוד מסוימים יכולים גם לשנות פנוטיפ התא מורפולוגיה על ידי הגדלת סינתזה חלבון דלקתיות וצמצום ביטוי הגן adipogenic 4 , המדגיש את החשיבות של פרוטוקול ששומרת על שלמות התאים.
התרבות של תאים ראשוניים subpopulations ספציפיים preadipocyte נותן גישה רדוקציוניסטית ב vivo צמיחה ושומרת המקבילה איפור גנטי התאית 5 , למרות עובד tiאותי עם תאים אלה מוגבלת בשל הידרדרות עם ההזדקנות, או ההזדקנות 6 . Preadipocytes ממחסני השומן השונים, כולל תת מחסן תת-ימורי ו omental, גם להפגין הבדלים התפשטות 7 , אשר מדגיש את החשיבות של איסוף תאים מאתרים אנטומיים ספציפיים. תאים מבשר מן הלא PVAT מחסן לבן מחסן מאופיינים במחקרים קודמים 7 , 8 , 9 , אבל פחות ידוע על פנוטיפים PVT APC.
הטכניקות המתוארות כאן מאפשרות ניתוח של אוכלוסיות ספציפיות ומוגדרות של APC, עם השפעה מזערית על המורפולוגיה שלהן, על יכולתן ועל פוטנציאלן להתרבות ולהבדיל. מגנטי המופעל תא תאים (MCS) הוא מקובל ליישומים במורד הזרם, כגון תרבות, כמו חרוזים להתמוסס מבלי לשנות את התא. MCS הוא גם חסכוני, ופעם נוגדן נוגדניםריכוזים תוקנו, הצורך מבחני cytometry זרימה היא מינימלית. מחקרים במבחנה עם מבשרי PVAT יכול גם לתת הצצה של הפוטנציאל כי תאים ראשוניים אלה עשויים להיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
המוקד המרכזי של הניסוי הנוכחי הוא בידוד, הרחבה, אדיפוגני אינדוקציה של APC מן המחסנים PVAT. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של APC מבוסס על זיהוי של תאים להביע את סמנים פני השטח CD34 ו PDGFRα. אלה חלבונים פני השטח זוהו בעבר על APC עם שיעורי התפשטות גבוהה ואת הפוטנציאל להבדיל adipocytes ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המעבדות Contreras ו ווטס וד"ר ויליאם רפאל. ניסויים אלה נתמכו על ידי NHLBI F31 HL128035-01 (רקמות העיכול פרוטוקול תקינה), NHLBI 5R01HL117847-02 ו 2P01HL070687-11A1 (בעלי חיים), ו NHLBI 5R01HL117847-02 (בידוד תאים ותרבות).
Materials
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| PBS 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48- Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. . in eLS. , (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
