Manyetik Aktive Hücre Ayırma ile İzole Edilen Perivasküler Adipoz Doku'ndan Adiposit Progenitörlerinin Genleşmesi ve Adipogenez İndüksiyonu
Summary
Burada Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MCS) kullanarak Perivasküler Adipoz Doku (PVAT) Adiposit Progenitör Hücre (APC) popülasyonlarının izolasyonu için bir yöntem rapor. Bu yöntem, floresan-Aktive Hücre Ayırma (FACS) ile karşılaştırıldığında, yağ dokusunun gramı başına APC'nin artan bir izolasyonuna izin verir.
Abstract
Parakrin sinyal vasıtasıyla vasküler fonksiyonların büyük düzenleyicisi olan perivasküler yağ dokusunun (PVAT) genişlemesi, obezite sırasında hipertansiyonun gelişimi ile doğrudan ilişkilidir. Hipertrofi ve hiperplazinin derecesi, depo yer, cinsiyet ve mevcut Adiposit Progenitör Hücre (APC) fenotiplerinin türüne bağlıdır. Son 10 yılda APC ve preadipositler izolasyonu için kullanılan teknikler, spesifik hücre yüzeyi belirteçlerine dayalı olarak tek tek hücrelerin tanımlanabileceği doğruluğunu büyük ölçüde geliştirmiştir. Bununla birlikte, APC ve adipositlerin izolasyonu, özellikle hücrelerin hücre kültürü uygulamaları için muhafaza edilmesi gerekiyorsa, hücrenin kırılganlığından dolayı bir meydan okuma olabilir.
Manyetik olarak aktive olan Hücre Ayırma ( MCS), yağ dokusunun ağırlık birimi başına daha fazla canlı APC'yi izole etmek için bir yöntem sağlar. MCS tarafından hasat edilen APC, preapeni genişletmek için in vitro protokoller için kullanılabilirDipositleri ve büyüme faktörü kokteyllerini kullanarak hücreler tarafından tutulan üretken ve adipojenik potansiyelin analizine izin vererek adipositlere ayırdık. Bu deney genişleme sırasında kardiyovasküler hastalığın gelişiminde kilit rol oynayan aortik ve mezenterik PVAT depoları üzerine odaklanmıştır. Bu protokoller, APC'nin tanımlanmış bir popülasyonunu izole etmek, genişletmek ve ayırmak için kullanılan yöntemleri tanımlamaktadır. Bu MCS protokolü, hücrenin sınıflandırılmasına minimum ekipman veya eğitimle ihtiyaç duyulan herhangi bir deneyde izolasyonun kullanılmasını sağlar. Bu teknikler, hücre yüzeyi markörlerinin varlığına dayanan spesifik hücre popülasyonlarının işlevselliğini belirlemek için ileri deneylere yardımcı olabilir.
Introduction
Perivasküler Adipoz Doku (PVAT), kan damarlarına yakın olması nedeniyle damar sistemi fonksiyonu 1'de önemli parakrin sinyal bileşenidir. Bu yağ dokusunun genleşmesi, 2 , 3 mevcut Adiposit Progenitör Hücrelerinin (APC) fenotipine bağlıdır. Primer adipositler kırılgan, yüzen ve aralıklı olduğundan, yağ dokularından hücrelerin izolasyonu zordur. Bazı izolasyon teknikleri aynı zamanda hücrelerin bütünlüğünü koruyan bir protokolün önemini vurgulayan, inflamatuvar protein sentezini arttırarak ve adipogenik gen ekspresyonunu azaltarak hücre fenotipini ve morfolojisini değiştirebilir.
Birincil hücrelerin kültürü ve spesifik preadiposit alt popülasyonları, in vivo büyümeye indirgemeci bir yaklaşım sağlar ve eşdeğer hücresel genetik yapıyı korur 5 , ancak tiYaşlanma, ya da yaşlanma 6 ile bozulma nedeniyle bu hücrelerle beni sınırlıdır. Deri altı ve omental depolar da dahil olmak üzere çeşitli yağ depolardan preadipositler, spesifik anatomik bölgelerden hücrelerin toplanmasının önemini vurgulayan proliferasyon 7'deki farklılıkları da gösterir. PVAT dışı beyaz yağ depolarından öncül hücreler önceki çalışmalar 7 , 8 , 9'da karakterize edilmiştir, ancak PVAT APC fenotipleri hakkında daha az bilgi bilinmektedir.
Burada açıklanan teknikler, morfolojileri, yaşayabilirlikleri ve çoğalması ve farklılaşması potansiyeli üzerinde asgari düzeyde etkisi olan spesifik ve tanımlanmış APC popülasyonlarının analiz edilmesine izin verir. Manyetik olarak aktive olan Hücre Ayırma (MCS), hücrenin değiştirilmeden boncukların çözünmesi nedeniyle kültür gibi müteakip uygulamalara uygundur. MCS de ekonomiktir ve bir kez antikor koniSantitler standart hale getirildiğinden, akış sitometrisi deneylerine olan ihtiyaç azdır. PVAT öncülleri ile yapılan in vitro çalışmalar, bu primer hücrelerin sahip olabileceği potansiyelin bir görüntüsünü de verebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu deneyin odak noktası PVAT depolarından APC'nin izolasyonu, genleşmesi ve adipogenik indüksiyonudur. Burada yüzey işaretleri CD34 ve PDGFRα ifade hücrelerin tanımlanması dayalı APC izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yüzey proteinleri daha önce APC üzerinde yüksek proliferasyon oranları ve çeşitli yağ depoları 14,15'te beyaz veya kahverengi adipositleri ayırma potansiyeli ile tanımlandı. Bu belirteçlere dayalı hücreleri seçerek, seçilen PVAT'de gözlemlenen adiposit feno…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Contreras and Watts Laboratuvarları ve Dr. William Raphael. Bu deneyler NHLBI F31 HL128035-01 (doku sindirim protokol standardizasyonu), NHLBI 5R01HL117847-02 ve 2P01HL070687-11A1 (hayvanlar) ve NHLBI 5R01HL117847-02 (hücre izolasyonu ve kültür) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| PBS 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48- Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
- Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
- Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
- Stacey, G. . in eLS. , (2001).
- Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
- Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
- Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
- Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
- Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
- Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
- Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
- Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034 (2015).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
