Expansion et adipogénèse Induction de progéniteurs d'adipocytes à partir de tissus adipeux périvasculaires isolés par tri magnétique de cellules activées
Summary
Nous rapportons ici une méthode pour l'isolement des populations de cellules progénitrices d'adipocytes (APC) à partir du tissu adipeux périvasculaire (PVAT) en utilisant le triage cellulaire activé par magnétisation (MCS). Cette méthode permet une augmentation de l'isolement de l'APC par gramme de tissu adipeux par rapport au tri de cellules activées par fluorescence (FACS).
Abstract
L'expansion du tissu adipeux périvasculaire (PVAT), un régulateur majeur de la fonction vasculaire par la signalisation paracrine, est directement liée au développement de l'hypertension pendant l'obésité. L'étendue de l'hypertrophie et de l'hyperplasie dépend de la localisation du dépôt, du sexe et du type de phénotypes cellulaires progéniteurs adipocytaires (APC) présents. Les techniques utilisées pour l'APC et l'isolement des préadipocytes au cours des 10 dernières années ont considérablement amélioré la précision à laquelle les cellules individuelles peuvent être identifiées en fonction de marqueurs de surface cellulaire spécifiques. Cependant, l'isolement de l'APC et des adipocytes peut être un défi en raison de la fragilité de la cellule, surtout si la cellule intacte doit être retenue pour les applications de culture cellulaire.
Le tri cellulaire activé par magnétisation ( MCS) fournit une méthode pour isoler un plus grand nombre d'APC viables par unité de poids de tissu adipeux. L'APC récolté par MCS peut être utilisé pour des protocoles in vitro pour développer les préLes dipocytes et les différencier en adipocytes par l'utilisation de cocktails à facteur de croissance permettant d'analyser le potentiel proliférateur et adipogène retenu par les cellules. Cette expérience a porté sur les dépôts PVAT aortiques et mésentériques, qui jouent un rôle clé dans le développement des maladies cardiovasculaires lors de l'expansion. Ces protocoles décrivent des méthodes pour isoler, développer et différencier une population définie d'APC. Ce protocole MCS permet d'utiliser l'isolation dans toute expérience où le tri cellulaire est nécessaire avec un équipement ou une formation minimale. Ces techniques peuvent aider d'autres expériences pour déterminer la fonctionnalité de populations cellulaires spécifiques en fonction de la présence de marqueurs de surface cellulaire.
Introduction
Le tissu adipeux périvasculaire (PVAT), en raison de sa proximité avec les vaisseaux sanguins, est un composant de signalisation paracrine majeur dans la fonction vasculaire 1 . L'expansion de ce tissu adipeux dépend du phénotype des cellules progénitrices d'adipocytes (APC) présentées 2 , 3 . L'isolement des cellules à partir de tissus adipeux est difficile car les adipocytes primaires sont fragiles, dynamiques et de taille. Certaines techniques d'isolement peuvent également modifier le phénotype et la morphologie cellulaire en augmentant la synthèse des protéines inflammatoires et en réduisant l'expression génétique adipogène 4 , en soulignant l'importance d'un protocole qui maintient l'intégrité des cellules.
La culture des cellules primaires et des sous-populations spécifiques de préadipocytes donne une approche réductionniste de la croissance in vivo et maintient un maquillage génétique cellulaire équivalent 5 , bien que le travailMoi avec ces cellules est limité en raison de la détérioration avec le vieillissement, ou la sénescence 6 . Les préadipocytes provenant de divers dépôts adipeux, y compris les dépôts sous-cutanés et omental, démontrent également des différences dans la prolifération 7 , ce qui met l'accent sur l'importance de la collecte de cellules à partir de sites anatomiques spécifiques. Les cellules précurseurs des dépôts adipeux blancs non PVAT ont été caractérisées dans les études précédentes 7 , 8 , 9 , mais on sait moins sur les phénotypes APAT de PVAT.
Les techniques décrites ici permettent l'analyse de populations APC spécifiques et définies ayant un impact minimal sur leur morphologie, leur viabilité et leur potentiel de prolifération et de différenciation. Le tri de cellules activé par magnétisation (MCS) est susceptible d'être utilisé dans les applications en aval, telles que la culture, car les grains se dissolvent sans altérer la cellule. MCS est également économique, et une fois que l'anticorps est conLes centrations ont été normalisées, le besoin de tests de cytométrie de flux est minime. Des études in vitro avec des précurseurs de PVAT peuvent également donner un aperçu du potentiel que ces cellules primaires peuvent avoir.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'objectif central de l'expérience actuelle est l'isolement, l'expansion et l'induction adipogène d'APC des dépôts PVAT. Nous présentons ici un protocole pour l'isolement de l'APC basé sur l'identification des cellules exprimant les marqueurs de surface CD34 et PDGFRα. Ces protéines de surface ont été précédemment identifiées sur APC avec des taux de prolifération élevés et le potentiel de se différencier en adipocytes blancs ou marron dans différents dépôts adipeu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les Laboratoires Contreras et Watts et le Dr William Raphael. Ces expériences ont été supportées par NHLBI F31 HL128035-01 (standardisation du protocole de digestion des tissus), NHLBI 5R01HL117847-02 et 2P01HL070687-11A1 (animaux) et NHLBI 5R01HL117847-02 (isolement et culture cellulaire).
Materials
| Tissue Dissection | |||
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Splinter Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann & Co | 105-400 | |
| KRBB Solution | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotic/Antimicotic | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Tissue Digestion | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | 1X Working Solution |
| Water Bath | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Reciprocal Shaking Bath |
| Biosafety Cabinet | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Rotisserie Incubator | Daigger | EF4894C | |
| 100 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Yellow |
| 40 µm Cell Strainer | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | Blue |
| Hemocytometer | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Cell Isolation | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | Medium Base |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Normal Donkey Serum | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC conjugated |
| Anti-PDGFRα | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| PBS 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Working Solution |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO2 Cell Incubator | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| 6-Well Plates | Corning | 3516 | TC-Treated |
| 48- Well Plates | Corning | 3548 | TC-Treated |
| 96-Well Plates, Black Wall | Corning | 353376 | TC-Treated |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | TC-Treated |
| Fetal Calf Serum | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantothenate | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutamine | Corning | 61-030 | |
| Bone Morphogenic Protein 4 | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Epidermal Growth Factor | PeproTech | 400-25 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | PeproTech | 250-02 | |
| Platelet-derived Growth Factor BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 450-33 | |
| Insulin | Corning | 25-800-CR | ITS Solution |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodothyronine) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Cell Analysis | |||
| CyQUANT Proliferation Assay | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Fluorescence Assay Reagent | Lonza | PT-7009 | |
| Oil Red O Lipid Dye Reagent | Sigma-Aldrich | O1391 | In Solution |
| M1000 Microplate Reader | Tecan | ||
| Eclipse Inverted Microscope | Nikon | ||
| Digital Sight DS-Qil Camera | Nikon |
References
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