세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도<em> 비브리오 균 (Vibrio parahaemolyticus)</em> Swimmer and Swarmer Cells
Summary
이 프로토콜은 차별적으로 구별되는 Vibrio parahaemolyticus 헤모글로빈 과 swarmer 세포의 단일 세포 현미경 검사를 가능하게합니다. 이 방법은 단일 세포 분석을 위해 쉽게 얻을 수있는 덩어리 세포 집단을 생산하고 세포 배양의 준비, 스웜머 분화의 유도, 샘플 준비 및 이미지 분석을 다루고있다.
Abstract
단백질의 세포 내 지방화를 연구하는 능력은 많은 세포 과정을 이해하는 데 필수적입니다. 이것은 세균 공동체 내에 존재하는 세포를 영상화 할 때 특히 어려울 수있는 형광 현미경 검사를 위해 단일 세포를 얻을 수있는 능력을 필요로합니다. 예를 들어, 인간 병원체 Vibrio parahaemolyticus 는 액상 조건에서 짧은 막대 모양의 수영 세포로 존재하며, 표면 접촉시 고체 표면에서의 성장을 위해 특수화 된 고도로 연장 된 스웜머 세포의 하위 모집단으로 분화한다. 이 논문은 V. parahaemolyticus 의 두 가지 미분 상태에서 단일 세포 형광 현미경 분석을 수행하는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 V.parahaemolyticus의 분열 세포주기를 매우 재현 가능하게 유도하여 고체 표면에 대한 증식을 촉진합니다. 상기 방법은 t로부터 연장되는 분화 된 스머머 셀의 플레어를 생성한다그는 군집 식민지의 가장자리에있다. 특히, 떼죽음의 끝에는 세포의 단일 층에 스머머 세포가 존재하기 때문에 현미경 슬라이드 및 단일 세포의 후속 형광 현미경 이미징으로 쉽게 전송할 수 있습니다. 또한, 박테리아 사회의 인구 통계 학적 표현을위한 이미지 분석의 워크 플로우가 제시됩니다. 원리의 증거로서, V.parahaemolyticus의 수영 세포 및 스머머 세포에서의 화학 주성 신호 전달 배열의 세포 내 국소화 분석 이 기재되어있다.
Introduction
박테리아는 끊임없이 외부 환경에 변화를 경험하고 이에 따라 행동을 변경하고 적응시키는 여러 기술을 개발했습니다. 그러한 메커니즘 중 하나는 변경된 환경을보다 잘 보완하는 별개의 세포 유형으로의 분화를 포함한다. 분화에는 종종 세포주기의 조절, 세포 형태학 및 세포의 시공간적 조직화에 주요 변화가 따른다. 분화를 겪을 수있는 한 가지 유기체는 부비강염 ( Vibrio parahaemolyticus) 입니다. V. parahaemolyticus 는 Vibrionaceae 에 속하며, 이는 일반적으로 신선한 물이나 소금물에 서식하는 proteobacteria 계열입니다. Vibrionaceae 는 환경 에 널리 분포하며 Vibrio cholerae.V를 포함하여 사람에서 장관 감염을 일으키는 몇 종을 포함 합니다. parahaemolyticus 는 이형 체 (dimorphic organism)이며, 그 변이 형 생물체에 대한 변화를 수용하기위한 반응으로서 2 가지 별개의 세포 유형으로 분화 할 수있다외부 환경. 수성 환경에서, 그것은 오래 막대 기둥에 위치한 단 극성 편모가있는 짧은 막대 모양의 수영 세포로 존재합니다. 표면 접촉시, 스머머 셀로의 분화가 유발된다. Swarmer 세포 분화는 두 가지 주요 변화를 포함한다 : 세포 분열의 억제를 통한 swarmer 세포 형태 형성 및 두 번째 편모 계의 유도. 그 결과 분열이 일어나고 매우 길어진 봉 모양의 swarmer 세포가 형성되는데, 분열 현상은 분열 현상을 일으켜 자손 swarmer 세포가되거나 swimer 세포로 다시 분화된다.
swarmer differentiation을 유도하거나 영향을 미치는 몇 가지 요인이보고되었다. 1 차 자극은 V. parahaemolyticus 가 표면 편에 회전의 억제를 감지하는 촉각 센서로 극모를 사용하는 메토 노 센싱 (mechanosensing) 에 의해 구동되는 것처럼 보이지만 몇 가지 다른 요인이우물 1 . 연구실에서는 북극 편모의 회전이 phenamil의 첨가에 의해 인위적으로 억제 될 수 있는데, 이는 나트륨 채널 구동 편모의 회전을 차단하여 스머머 분화를 유도한다. 또한, 초기 연구에서, Vibrio alginolyticus 는 투명한 플라스틱 테이프로 봉인 된 페트리 접시의 성장 배지에서 세포가 증식 될 때 고체 배지에서 떼 지어 유도되었다. 알칼리가 포화 된 여과지는 이러한 조건에서 휩쓸 기를 방지하여 하나 이상의 휘발성 산이 휩쓸 기의 유도에 관여 할 수 있음을 암시합니다. 따라서, 페트리 접시를 플라스틱 테이프로 밀봉하면 판의 헤드 공간 내에 세포 대사의 부산물로 형성된 휘발성 산이 축적 될 가능성이 높습니다. H2O2를 밀봉되지 않은 배양 접시에서 성장 배지에 첨가하여 배지 성분을 가수 분해하여 휘발성 산을 인위적으로 생산할 때도 동일한 효과가 나타났다 <supclass = "xref"> 3 , 4 , 5 . 그럼에도 불구하고 그러한 휘발성 산의 정체는 알려지지 않았습니다. 또한, 칼슘 6 과 철 제한 7 의 과도한 가용성은 모두 고체 표면보다 스와머 분화 및 증식을 강화시키는 것으로 나타났습니다. 세포는 화합물 2.2'-Bipyridyl을 swarmer differentiation 8 에 영향을 미치는 것으로 보이는 성장 배지에 첨가함으로써 철분을 굶어 죽을 수있다. 분화를 조절하는 것으로 알려진 인자는 현재 스와머 세포로의 비장 세포 분화를 유도하고 고체 한천 표면에서 그의 증식을 재현 가능하게 유도하는 프로토콜의 설계에서 실행된다.
베로니카 parahemolyticus 의 분화는 세포 분열의 조절, 세포 형태 및 깃대와 같은 거대 분자 기계의 위치의 주요 변화를 포함한다화학 주성기구 (chemotaxis apparatus) – 세포주기에 따라 단백질의 특정 위치를 요구하는 과정. 따라서, 그러한 단백질의 세포 내 국지화를 연구하는 능력은 전술 한 세포 과정의 이해에 필수적이다. 이러한 연구를 수행하기 위해서는 단일 세포에서 형광 현미경 검사가 필요합니다. 이것은 swarmer 세포의 경우처럼 밀도가 높은 세균 집단 내에 존재하는 세포를 영상화 할 때 특히 어려울 수 있습니다. 현미경 연구를 위해 잠재적으로 단일 세포를 생성 할 수있는 액체 배지에서 스머머 분화를 유도하려는 시도가 있었다. 그리고 전사 수준에서이 세포들은 부분적으로 swarmer-differentiation 프로그램을 유도하지만 고체 배지에서 완전히 분화 된 swarmer 세포와 동일한 형태 학적 변화를 겪지는 않습니다 8 . 이 논문은 강력하고 재현성있는 방법을 제안한다.한천 표면의 차별화. 이 프로토콜은 단일 셀 현미경 검사 및 후속 분석을 위해 쉽게 접근 할 수있는 스머머 세포 집단을 쉽게 생성합니다. 또한, 프로토콜은 수영과 swarmer 세포 유형 (섹션 1, 2, 3, 4) 모두에서 형광 라벨 단백질의 현지화 연구를 가능하게합니다. 또한이 프로토콜은 박테리아 사회의 인구 통계 학적 분석을 가능하게하는 형광 현미경 실험에서 생성 된 데이터를 처리하고 분석하는 방법에 대한 후속 작업 과정을 설명합니다 (섹션 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 V. parahaemolyticus swarmer 세포의 현미경 검사법에 대한 방법을보고하고, subcellular localization과 연구 된 형광 표지 단백질의 다른 특징을 분석하고 정량화하기위한 하향 분석을 수행 하였다. 현미경 검사 이미지 처리 및 분석을위한 몇 가지 도구가 있지만 14 , 15 , 16 , 17 , <sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 Max Planck Society에서 지원했습니다.
Materials
| Media components | |||
| LB-medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB-medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | – | – | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150x20mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | – | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | – | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | – | Used for microscopy data analsis |
References
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