सेलुलर भेदभाव और सिंगल सेल इमेजिंग का प्रेरण<em> विब्रियो परहामोलीटिकस</emतैरने वाला और स्वांबर कक्ष
Summary
इस प्रोटोकॉल को अलग-अलग विब्रियो पैराहामोलिटिकस तैराक और सजीर कोशिकाओं के एकल सेल माइक्रोस्कोपी को सक्षम बनाता है। विधि सिंगल सेल विश्लेषण के लिए आसानी से उपलब्ध झिल्लीदार कोशिकाओं की आबादी का उत्पादन करती है और सेल संस्कृतियों की तैयारी, स्वर्गर भेदभाव, नमूना तैयार करने, और छवि विश्लेषण को शामिल करता है।
Abstract
कई सेलुलर प्रक्रियाओं की समझ के लिए प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण का अध्ययन करने की क्षमता आवश्यक है। बदले में, यह प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने की क्षमता की आवश्यकता होती है, जो विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब इमेजिंग कोशिकाएं जीवाणु समुदायों के भीतर मौजूद हों। उदाहरण के लिए, मानव रोगाणु विब्रियो पैराहामोलिटिकस द्रव स्थितियों में छोटे छड़ी के आकार का तैराक कोशिकाओं के रूप में मौजूद है, जो कि सतह के संपर्क पर ठोस सतहों पर विकास के लिए विशेष रूप से अत्यधिक बढ़ाव वाले स्वर्मर कोशिकाओं के उप-जनन में विभेद करते हैं। इस पत्र में वी। पैराहामोलिटिकस के दो विभेदक राज्यों में एकल कोशिका प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत की गई है। यह प्रोटोकॉल बहुत प्रजननशील रूप से वी। पैराहामोलिटिकस के भेदभाव को स्वर्गर कोशिका जीवन-चक्र में भेद करता है और ठोस सतहों पर उनके प्रसार को सुविधाजनक बनाता है। विधि टी से विस्तार विभेदित swarmer कोशिकाओं के flares पैदा करता हैवह झुंड-कॉलोनी का किनारा है विशेष रूप से, झुंड-ज्वाला के बहुत टिप पर, कोशिकाओं की एक परत में झुकाव वाले कोशिकाएं मौजूद होती हैं, जो एक खुर्दबीन स्लाइड और एकल कोशिकाओं के बाद के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए आसान स्थानांतरण की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, बैक्टीरियल सोसायटी के जनसांख्यिकीय प्रतिनिधित्व के लिए छवि विश्लेषण का कार्यप्रवाह प्रस्तुत किया गया है। सिद्धांत के एक प्रमाण के रूप में, वी। परहामोल्यटिकस के तैराक और झिल्लीदार कोशिकाओं में चेमोटेक्सिस के सिग्नल एरे के इंट्राससेल्युलर स्थानीयकरण का विश्लेषण किया गया है।
Introduction
जीवाणु लगातार अपने बाहरी माहौल में परिवर्तन का अनुभव करते हैं और तदनुसार उनके व्यवहार को बदलने और उनका अनुकूलन करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया है। ऐसा ही एक तंत्र में भिन्न सेल प्रकारों में भेदभाव शामिल होता है जो बेहतर पर्यावरण के पूरक हैं। भेदभाव में अक्सर कोशिका चक्र, कोशिका आकृति विज्ञान, और कोशिकाओं के spatiotemporal संगठन के नियमन में बड़े बदलाव शामिल हैं। एक जीव है जो भेदभाव से गुज़र सकता है, विब्रियो पैराहामोलिटिकस है । वी। पैराहामोलिटिकस विब्रोनियासीई से संबंधित है, जो कि प्रोटीबैक्टीरिया का एक परिवार होता है जो आमतौर पर ताजा या नमक पानी में रहते हैं। वाइब्रोनेसाई को पर्यावरण में व्यापक रूप से वितरित किया जाता है और इसमें कई प्रजातियां शामिल हैं जो मनुष्यों में आंतों के संक्रमण का कारण बनती हैं, जिनमें विब्रियो कोलेरे भी शामिल हैं। पैराहामोलिटाइकस एक दिमालिक जीव है और दो अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम है जैसे कि इसके परिवर्तनों को समायोजित करने के लिए प्रतिक्रियाबाह्य परिवेश जलीय वातावरण में, यह एक छोटे छड़ी के आकार का तैराक कोशिका के रूप में होता है जिसमें पुराने कोशिका पोल पर स्थित एक ध्रुवीय फ्लैगेलम होता है। सतह संपर्क पर, एक swarmer सेल में भेद शुरू हो रहा है। सुगम सेल भेदभाव में दो बड़े बदलाव शामिल हैं: सेल डिवीजन के निषेध के माध्यम से झुकाव सेल morphogenesis, और एक दूसरे flagella प्रणाली की प्रेरण। इससे एक विकृत और अत्यधिक लम्बी छड़ी के आकार वाले स्विर्मर सेल के निर्माण में परिणाम आता है, जो या तो जीवन शैली का जीवन जारी कर सकता है, जहां विभाजन घटनाओं के परिणाम संतान संचरित कोशिकाओं में होते हैं या वैकल्पिक रूप से तैराक कोशिकाओं में वापस अंतर करते हैं।
कई कारकों को झुकाव के भेदभाव को प्रेरित करने या प्रभावित करने के लिए सूचित किया गया है प्राथमिक उत्तेजना तंत्र को संचालित करने के लिए प्रतीत होता है जहां वी। पैराहामोलिटिकस ध्रुवीय फ्लैगेलम को एक स्पर्श संवेदक के रूप में उपयोग करता है जो सतह संपर्क पर रोटेशन के निषेध का पता लगाता है, लेकिन कई अन्य कारक शामिल हैंअच्छी तरह से 1 प्रयोगशाला में, ध्रुवीय ध्वज का रोटेशन कृत्रिम रूप से फ़िनमिल को जोड़कर बाधित किया जा सकता है, जो सोडियम-चैनल चालित फ्लिगलर रोटेशन को अवरुद्ध करता है, जिससे स्वर्मर भेदभाव 2 प्रेरित होता है इसके अलावा, पहले के एक अध्ययन में, विब्रियो अलिजिनोलिटिकस को ठोस मीडिया पर झुकाव के लिए प्रेरित किया गया था जब कोशिकाओं को एक पेट्री डिश में विकास माध्यम पर प्रचारित किया गया था जो स्पष्ट प्लास्टिक टेप के साथ बंद हुआ था। क्षार-संतृप्त फिल्टर पेपर इन स्थितियों के तहत झुंड को रोका जा रहा है, इसलिए यह सुझाव दे रहा है कि एक या अधिक वाष्पशील एसिड को झुकाव के शामिल करने में शामिल किया जा सकता है। इस प्रकार, प्लास्टिक टेप के साथ पेट्री डिश को सील करने से संभवतः वोल्टिल एसिड के संचय के लिए अनुमति होती है, जिसे प्लेट के सिर वाले स्थान के भीतर सेलुलर चयापचय के द्वारा उत्पादित किया जाता है। उसी प्रभाव को हासिल किया गया, जब एच 2 ओ 2 को अप्रबंधित पेट्री डिश में विकास माध्यम में जोड़ दिया गया, ताकि कृत्रिम रूप से मीडिया घटकों द्वारा हाइड्रोलाइज़िंग द्वारा अस्थिर एसिड का उत्पादन किया जा सके। <supवर्ग = "xref"> 3 , 4 , 5 फिर भी, ऐसे अस्थिर एसिड की पहचान अज्ञात बनी हुई है। इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि कैल्शियम 6 और लोहे-सीमा 7 की अतिरिक्त उपलब्धता दोनों ठोस सतहों पर स्वस्थ भेदभाव और प्रसार को बढ़ाते हैं। कोशिकाएं लोहे के लिए भूख से ग्रस्त हो सकती हैं, जो 2,2-बीपीआईडिल को विकास माध्यम से जोड़ती हैं, जो कि झुंड भेदभाव 8 को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। भेदभाव को विनियमित करने वाले कारक अब एक प्रोटोकॉल के डिजाइन में लागू किए गए हैं जो प्रजननशील रूप से वी। पैराहामोलिटिकस भेदभाव को स्वर्गर कोशिकाओं में लाते हैं और ठोस एगर सतहों पर उनका प्रसार करते हैं।
वी। पैराहामोलिटेकस भेदभाव में सेल डिवीजन, सेलुलर आकृति विज्ञान, और मैक्रोमोलेक्यूलर मशीनों की स्थिति जैसे फ्लॉगरए और केमोटाक्सिस एपार्टसस – प्रक्रियाओं के लिए सभी को सेल चक्र के अनुसार प्रोटीन के विशिष्ट स्थानीयकरण की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, उपर्युक्त सेलुलर प्रक्रियाओं की समझ के लिए ऐसे प्रोटीन के इंटरासेल्युलर स्थानीयकरण का अध्ययन करने की क्षमता आवश्यक है। ऐसे अध्ययन करने के लिए एकल कोशिकाओं पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी आवश्यक है। यह विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है जब इमेजिंग कोशिकाएं घने बैक्टीरियल आबादी के भीतर मौजूद होती हैं, जैसे कि स्विर्मर कोशिकाओं के मामले हैं। तरल मीडिया में झुकावपूर्ण भेदभाव को प्रेरित करने के प्रयास किए गए हैं, जो संभवत: माइक्रोस्कोपी अध्ययन के लिए एकल कक्ष उत्पन्न कर सकते हैं। और यद्यपि ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर इन कोशिकाओं ने आंशिक रूप से स्विर्मर-भेदभाव कार्यक्रम को प्रेरित किया है, वे एक ही अलग रूपिकी परिवर्तनों से गुज़रते नहीं हैं, क्योंकि ठोस माध्यम 8 पर विकसित होने वाले पूरी तरह भेदभाव वाले सेल। इस पत्र में झुमके सीई को प्रेरित करने के लिए एक विधि के एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रदान करता हैएक अगर सतह पर भेदभाव करेंगे प्रोटोकॉल एकल सेल माइक्रोस्कोपी और बाद के विश्लेषण के लिए आसानी से उपलब्ध आसानी से swarmer कोशिकाओं की आबादी पैदा करता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल दोनों तैराक और swarmer सेल-प्रकार (खंड 1, 2, 3, 4) में fluorescently लेबल प्रोटीन के स्थानीयकरण अध्ययन सक्षम बनाता है। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल, बाद के कार्यप्रवाह का वर्णन करता है कि कैसे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रयोगों से जनरेटेड डेटा को संसाधित करने और विश्लेषण करने के लिए, जो कि बैक्टीरियल सोसायटियों (अनुभाग 5) के जनसांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पत्र वी। पैराहामोलिटिकस स्विर्मर कोशिकाओं की माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए एक विधि की रिपोर्ट करता है, इसके बाद के अध्ययन के अनुसार, सेल्युलुलर स्थानीयकरण और अध्ययन किए गए फ्लोरोसेंटली लेबल प्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम मैक्स प्लैंक सोसाइटी द्वारा समर्थित था।
Materials
| Media components | |||
| LB-medium | Roth | X968.3 | |
| Difco Agar, granulated | BD | 214510 | For preparation of LB agar with LB-medium |
| Difco Heart Infusion Agar | BD | 244400 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Agarose NEEO, ultra quality | Roth | 2267.3 | For preparation of microscopy agarose pads |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Additives | |||
| L-arabinose | Roth | 5118.3 | Used to induce pBAD derivatives |
| 2,2`-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305-25G | For preparation of HI agar swarming plates |
| Calcium chloride dihydrate | Roth | 5239.1 | For preparation of HI agar swarming plates |
| Ampicillin sodium salt | Roth | K029.3 | |
| Chloramphenicol | Roth | 3886.3 | |
| PBS buffer | – | – | Standard recipe for Phosphate-buffered saline |
| D(+) Sucrose | Roth | 4621.1 | For preparation of electrocompetent cells |
| Glycerol | Roth | 3783.5 | For preparation of electrocompetent cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hardware | |||
| Petri dish 150x20mm with cams | Sarstedt | 82.1184.500 | For preparation of HI agar swarming plates |
| kelvitron t (B 6420) | Heraeus | – | Used for drying HI agar swarming plates |
| Gene Pulser Xcell Microbial System | BioRad | 1652662 | Used for elctroporation of plasmid DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| MetaMorph Offline (version 7.7.5.0) | Molecular Devices | – | Used for microscopy image analysis |
| Excel | Microsoft | – | Used for microscopy data analsis |
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