Induksjon av Cellulær Differensiering og Single Cell Imaging of<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Svømmer- og svovelceller

Summary

Denne protokollen muliggjør singlecellemikroskopi av de differensielt forskjellige Vibrio parahaemolyticus svømmer- og svømmerceller. Metoden produserer en populasjon av swarmersceller som er lett tilgjengelige for enkelcelleanalyser og dekker fremstilling av cellekulturer, induksjon av swarmer-differensiering, prøvepreparasjon og bildeanalyse.

Abstract

Evnen til å studere intracellulær lokalisering av proteiner er avgjørende for forståelsen av mange cellulære prosesser. I sin tur krever dette evnen til å skaffe enkeltceller for fluorescensmikroskopi, noe som kan være spesielt utfordrende når avbildningsceller som finnes i bakterielle samfunn. For eksempel eksisterer det humane patogenet Vibrio parahaemolyticus som korte stavformede svømmerceller i flytende forhold som ved overflatekontakt skiller seg inn i en delpopulasjon av svært langstrakte svømmerceller spesialisert for vekst på faste overflater. Dette papiret presenterer en metode for å utføre single cell fluorescensmikroskopi analyse av V. parahaemolyticus i sine to differensialtilstander. Denne protokollen induserer meget differensiering av V. parahaemolyticus til en livscykel i svovelceller og letter deres spredning over faste overflater. Metoden produserer flammer av differensierte svømmerceller som strekker seg fra tHan kanten av svømmekolonien. Spesielt, i spissen av swarm-fakkene, finnes svømmerceller i et enkelt lag av celler, noe som muliggjør enkel overføring til et mikroskopdia og etterfølgende fluorescensmikroskopi av enkeltceller. I tillegg presenteres arbeidsflyten av bildeanalyse for demografisk representasjon av bakterielle samfunn. Som prinsippsbestemmelse er analysen av intracellulær lokalisering av kjemotaksis-signaleringsarrayer i svømmer- og svovelceller av V. parahaemolyticus beskrevet.

Introduction

Bakterier opplever hele tiden endringer i deres ytre miljø og har utviklet flere teknikker for å endre og tilpasse deres oppførsel tilsvarende. En slik mekanisme innebærer differensiering i forskjellige celletyper som bedre utfyller det forandrede miljøet. Differensiering innebærer ofte store endringer i reguleringen av cellesyklusen, cellemorfologi og spatiotemporal organisering av cellene. En organisme som kan gjennomgå differensiering er Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus tilhører Vibrionaceae , som er en familie av proteobakterier som vanligvis lever i frisk eller saltvann. Vibrionaceae er utbredt i miljøet og inkluderer flere arter som forårsaker tarmkanalinfeksjoner hos mennesker, også inkludert Vibrio cholerae. V. Parahaemolyticus er en dimorf organisme og er i stand til å skille seg inn i to forskjellige celletyper som et svar for å imøtekomme endringer i detsEksternt miljø. I vandige miljøer eksisterer den som en kort stavformet svømmercelle med en enkelt polar flagellum plassert ved den gamle cellepolen. Ved overflatekontakt utløses differensiering i en sværmercelle. Swarmercelle-differensiering innebærer to store endringer: svovelcellemorfogenese gjennom inhibering av celledeling, og induksjon av et andre flagellasystem. Dette resulterer i dannelsen av en peritrichøs og langstrakt stangformet sværmercelle, som enten kan fortsette sværmerens livsstil, hvor delingshendelser resulterer i avkomme swarmerceller, eller alternativt differensiere tilbake til svømmerceller.

Flere faktorer har blitt rapportert å indusere eller påvirke swarmer differensiering. Den primære stimulansen ser ut til å være drevet av mekanosensing hvor V. parahaemolyticus bruker polar flagellum som en taktil sensor som påviser inhibering av rotasjonen ved overflatekontakt, men flere andre faktorer er involvert somBrønn ¹ . I laboratoriet kan rotasjon av det polære flagellum inhiberes kunstig ved tilsetning av fenamil, som blokkerer den natriumkanal-drevne flagellære rotasjonen, og derved fremkaller sværmerdifferensiering ² . Videre ble i en tidligere studie indusert Vibrio alginolyticus til å svømme på fast medium når celler ble forplantet på vekstmedium i en Petri-skål forseglet med klart plastbånd. Alkali-mettet filterpapir forhindret å swarming under disse forholdene, og dermed foreslå at en eller flere flyktige syrer kan være involvert i induksjon av swarming. Således forsegler Petri-skålen med plastbånd som sannsynligvis er tillatt for akkumulering av flyktige syrer, dannet som biprodukter av cellemetabolismen, innenfor platens hovedområde. Den samme effekt ble oppnådd når H202 ble tilsatt til vekstmediet i uforseglede petriskål for å kunstig fremstille flyktige syrer ved hydrolysering av mediekomponenter <supClass = "xref"> 3 ^{, 4 , 5} . Likevel er identiteten til slike flyktige syrer ukjent. Videre har det vist seg at overskytende tilgjengeligheten av kalsium ⁶ og jernbegrensning ⁷ begge forbedrer svarte-differensiering og spredning over faste overflater. Celler kan sultes for jern ved å tilsette forbindelsen 2,2'-Bipyridyl til vekstmediet, som har vist seg å påvirke svarte-differensiering ⁸ . Faktorene som er kjent for å regulere differensiering, implementeres nå i utformingen av en protokoll som reproduserbart forårsaker V. parahaemolyticus- differensiering i sværmerceller og deres spredning på faste agaroverflater.

V. parahaemolyticus-differensiering innebærer store endringer i reguleringen av celledeling, cellemorfologi og posisjonering av makromolekylære maskiner som flagellA og kjemotaksisapparater – prosesser som alle krever spesifikk lokalisering av proteiner i samsvar med cellesyklusen. Dermed er evnen til å studere intracellulær lokalisering av slike proteiner avgjørende for forståelsen av de nevnte cellulære prosesser. For å utføre slike studier er det nødvendig med fluorescensmikroskopi på enkeltceller. Dette kan være spesielt utfordrende når avbildningsceller som finnes i tette bakteriepopulasjoner, som det er tilfelle for sværmerceller. Det har vært forsøk på å indusere sværmerdifferensiering i flytende medier, som potensielt kan generere enkeltceller for mikroskopi-studier. Og selv om disse cellene på et transkripsjonsnivå delvis har indusert swarmer-differensieringsprogrammet, gjennomgår de ikke de samme tydelige morfologiske forandringene som fullt differensierte svømmerceller dyrket på fast medium ⁸ . Dette papiret gir en robust og reproducerbar protokoll av en metode for å indusere sværmerLl differensiering på en agaroverflate. Protokollen produserer en populasjon av lett tilgjengelige swarmersceller som er lett tilgjengelige for enkeltcellemikroskopi og etterfølgende analyse. Videre muliggjør protokollen lokaliseringsstudier av fluorescensmerkede proteiner i både svømmer- og svømmercelletyper (avsnitt 1, 2, 3, 4). I tillegg beskriver protokollen den etterfølgende arbeidsflyten på hvordan å behandle og analysere de genererte dataene fra fluorescensmikroskopieksperimenter, noe som muliggjør demografisk analyse av bakterielle samfunn (seksjon 5).

Protocol

1. Fremstilling av elektrokompetente V. parahaemolyticusceller og elektroporering av plasmid-DNA i svømmerceller MERK: Følgende del av protokollen tillater fremstilling av elektrokompetente celler og påfølgende elektroporation av plasmid-DNA i svømmerceller. Dette trinnet er viktig hvis fluorescerende proteiner eksploderes ectopisk fra et plasmid. Strek ut V. parahaemolyticus- celler fra en -80 ° C glycerol-stamme på en frisk LB-agarplate innehold…

Representative Results

Induksjon av differensiering og generering av swarming kolonier Figur 1 gir et skjema over de viktige trinnene som er involvert i å produsere sværmende kolonier av V. parahaemolyticus ( Figur 1A-C ). En svømmerkultur ble oppdaget på swarm-agar og inkubert ved 24 ° C, hvilket induserte svovel-differensiering og proliferasjon over den faste agaroverflaten. Et representativt…

Discussion

Dette papiret rapporterer en metode for mikroskopisk avbildning av V. parahaemolyticus swarmersceller, etterfulgt av nedstrømsanalyser beregnet på å løse og kvantifisere subcellulær lokalisering og andre trekk ved de studerte fluorescensmerkede proteiner. Selv om flere verktøy eksisterer for mikroskopi bildebehandling og analyse ^{14 , 15 , 16 , 17 , 1…}

Materials

Media components
LB-medium	Roth	X968.3
Difco Agar, granulated	BD	214510	For preparation of LB agar with LB-medium
Difco Heart Infusion Agar	BD	244400	For preparation of HI agar swarming plates
Agarose NEEO, ultra quality	Roth	2267.3	For preparation of microscopy agarose pads
Name	Company	Catalog Number	Comments
Additives
L-arabinose	Roth	5118.3	Used to induce pBAD derivatives
2,2`-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305-25G	For preparation of HI agar swarming plates
Calcium chloride dihydrate	Roth	5239.1	For preparation of HI agar swarming plates
Ampicillin sodium salt	Roth	K029.3
Chloramphenicol	Roth	3886.3
PBS buffer	–	–	Standard recipe for Phosphate-buffered saline
D(+) Sucrose	Roth	4621.1	For preparation of electrocompetent cells
Glycerol	Roth	3783.5	For preparation of electrocompetent cells
Name	Company	Catalog Number	Comments
Hardware
Petri dish 150x20mm with cams	Sarstedt	82.1184.500	For preparation of HI agar swarming plates
kelvitron t (B 6420)	Heraeus	–	Used for drying HI agar swarming plates
Gene Pulser Xcell Microbial System	BioRad	1652662	Used for elctroporation of plasmid DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)	Molecular Devices	–	Used for microscopy image analysis
Excel	Microsoft	–	Used for microscopy data analsis