Imunocoloración Cuádruple del Bulbo Olfativo para la Visualización de Códigos de Identidad Molecular del Axón Sensorial Olfativo
Summary
Las neuronas sensoriales olfativas expresan una amplia variedad de moléculas de clasificación de axones para establecer circuitos neurales adecuados. Este protocolo describe un método de tinción inmunohistoquímica para visualizar las expresiones combinatorias de las moléculas de clasificación de axones en los terminales axónicos de las neuronas sensoriales olfatorias.
Abstract
El sistema olfativo de ratón se utiliza a menudo para estudiar los mecanismos de formación de circuitos neuronales debido a su estructura anatómica simple. Una Neurona Sensorial Olfativa (OSN) es una célula bipolar con una sola dendrita y un solo axón no ramificado. Un OSN expresa sólo un gen receptor Olfactory (OR), OSNs que expresan un determinado tipo de OR convergen sus axones a unos pocos conjuntos de glomérulos invariantes en el Olfactory Bulb (OB). Una característica notable de la proyección de OSN es que las RUP expresadas desempeñan papeles instructivos en la proyección axonal. Las OR regulan la expresión de múltiples moléculas de clasificación de axones y generan el código molecular combinatorio de las moléculas de clasificación de axones en los terminales axónicos de OSN. Por lo tanto, para comprender los mecanismos moleculares de los mecanismos de orientación de axones específicos de OR, es vital para caracterizar sus perfiles de expresión en el OSN terminales axón dentro del mismo glomérulo. El objetivo de este artículo fue introducir métodos para recoger tantos glomérulos como possiblE en una única sección de OB y para realizar la inmunotinción usando múltiples anticuerpos. Esto permitiría la comparación y el análisis de los patrones de expresión de las moléculas de clasificación de axones sin variación de tinción entre las secciones OB.
Introduction
Durante el desarrollo, las neuronas están conectadas con precisión entre sí para formar circuitos neurales adecuados, lo cual es crítico para la función cerebral normal. Dado que los circuitos neuronales aberrantes en el cerebro se piensa que son la causa de trastornos mentales como el autismo y la esquizofrenia, la comprensión de los mecanismos de formación de circuitos neuronales es uno de los principales desafíos en el campo de la neurociencia.
En el sistema olfativo de ratón, cada Neurona Sensorial Olfativa (OSN) en el Epitelio Olfativo (OE) expresa solamente un gen funcional del Receptor Olfativo (OR) y OSNs que expresan el mismo O convergen sus axones a un par específico de glomérulos en localizaciones estereotipadas en el Bulbo Olfativo (OB) 1 , 2 . El sistema olfativo de ratón es un excelente sistema modelo para estudiar los mecanismos moleculares de la formación de circuitos neuronales porque los investigadores pueden utilizar la expresión OR para identificar unaUbtype de OSNs y visualizar los sitios de proyección de axones OSN como estructuras glomerulares claras. Una característica notable de la proyección de OSN es que las RUP desempeñan papeles instructivos en la proyección de axones OSN a la OB 3 , 4 , 5 , 6 . Más específicamente, después de que los axones de OSN son guiados para aproximar regiones diana, se segregan para formar glomérulos de una manera dependiente de OR. Estudios previos han demostrado que las moléculas OR control de la expresión de axón de clasificación de las moléculas, que regulan la segregación glomerular [ 7 , 8] . Además, la acumulación de pruebas sugiere que las moléculas OR generar el código de identidad neuronal por una combinación única de axón de clasificación de moléculas [ 9] . Por lo tanto, para comprender el mecanismo de la segregación glomerular dependiente de OR, es necesario caracterizar los perfiles de expresión de axon-sorting molEcules en OSNs.
La inmunotinción fluorescente es un método común para visualizar la expresión de genes específicos. Dado que las proteínas de las moléculas de clasificación de axones se localizan predominantemente a axones OSN, los investigadores necesitan utilizar secciones OB para caracterizar sus patrones de expresión en OSN. La sección coronaria del OB se ha utilizado de forma rutinaria para la inmunotinción. Sin embargo, esta preparación pierde la información topográfica a lo largo del eje anterior-posterior en la misma sección OB. Por lo tanto, desarrollamos una preparación parasagital del lado medial del OB, que puede montar tantos glomérulos circundantes como sea posible en la misma sección OB. Combinada con la inmunotinción utilizando múltiples anticuerpos, esta preparación permite la comparación y el análisis de los patrones de expresión de las moléculas de clasificación de axones sin manchas de variación entre las secciones OB.
Además, se ha presentado un método de tinción inmunohistoquímica sin post-fijación con PFA aTratamiento con sacarosa. Este método permite a los investigadores obtener suficientes datos de tinción de alta calidad para el análisis de datos multivariables. Los protocolos presentados aquí proporcionarán detalles de métodos poderosos para los investigadores que estudian la formación del circuito neural olfativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inmunotinción cuádruple de las secciones OB parasagitales permitió la visualización y cuantificación de los niveles de expresión de hasta cuatro moléculas de clasificación de axones simultáneamente en un mayor número de glomérulos. Al analizar estos datos multivariables con PCA, se pueden especular las características para la expresión de esas moléculas.
Para una tinción exitosa, la preparación de muestras de tejido es de importancia crítica. Algunos protocolos sugieren q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Mitsubishi, la Fundación de Ciencias Takeda, JST PRESTO y JSPS KAKENHI Grant Número 16H06144.
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
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