Четырёхкратное иммуноокрашивание обонятельной луковицы для визуализации обонятельных сенсорных аксонов Молекулярные коды идентичности
Summary
Ольфакторные сенсорные нейроны выражают широкое разнообразие молекул, сортирующих аксоны, для установления правильной нейронной схемы. В этом протоколе описывается метод иммуногистохимического окрашивания для визуализации комбинаторных выражений молекул аксоновской сортировки на концах аксонов обонятельных сенсорных нейронов.
Abstract
Обонятельная система мыши часто используется для изучения механизмов формирования нейронных схем из-за ее простой анатомической структуры. Обонятельный сенсорный нейрон (OSN) представляет собой биполярную клетку с единственным дендритом и одним неразветвленным аксоном. OSN выражает только один ген обонятельного рецептора (OR), OSN, выражающие данный тип OR, сходятся к их аксонам к нескольким наборам инвариантных клубочков в Offactory Bulb (OB). Замечательной особенностью проекции OSN является то, что выраженные ORs играют поучительные роли в аксонной проекции. ORs регулируют экспрессию нескольких молекул, сортирующих аксонов, и генерируют комбинаторный молекулярный код молекул, сортирующих аксоны, на концах аксонов OSN. Таким образом, чтобы понять молекулярные механизмы OR-специфических механизмов наведения аксонов, очень важно охарактеризовать их профили экспрессии на терминах аксонов OSN в пределах того же клубочка. Целью этой статьи было введение методов сбора как можно большего количества клубочковE на одном участке ОВ и для проведения иммуноокрашивания с использованием нескольких антител. Это позволило бы сравнить и проанализировать образцы экспрессии молекул аксоновской сортировки без изменения окраски между разделами ОВ.
Introduction
Во время развития нейроны точно связаны друг с другом с образованием правильных нейронных цепей, что имеет решающее значение для нормальной функции мозга. Поскольку аберрантные нейронные цепи в мозге считаются причиной психических расстройств, таких как аутизм и шизофрения, понимание механизмов формирования нейронных каналов является одной из основных проблем в области нейронауки.
В обонятельной системе мыши каждый обонятельный сенсорный нейрон (OSN) в обонятельном эпителии (OE) выражает только один функциональный ген обонятельного рецептора (OR), а OSN, выражающие один и тот же OR, сходятся к их аксонам к определенной паре клубочков в стереотипных местах в Ольфакторная лампа (ОБ) 1 , 2 . Обонятельная система мыши является превосходной модельной системой для изучения молекулярных механизмов образования нейронных цепей, поскольку исследователи могут использовать выражение OR для определения специфического sUbtype OSNs и визуализировать проекционные сайты аксонов OSN как прозрачные клубочковые структуры. Замечательной особенностью проекции OSN является то, что ORs играют поучительные роли при проектировании аксонов OSN в OB 3 , 4 , 5 , 6 . Более конкретно, после того, как аксоны OSN направляются в приближенные целевые области, они отделяются для образования клубочка с помощью OR-зависимого способа. Предыдущие исследования показали, что молекулы OR контролируют экспрессию аксонобразующих молекул, которые регулируют селегацию клубочков 7 , 8 . Более того, накопление данных свидетельствует о том, что молекулы OR генерируют нейронный идентификационный код с помощью уникальной комбинации молекул, сортирующих аксоны 9 . Таким образом, чтобы понять механизм OR-зависимой клубочковой сегрегации, необходимо охарактеризовать профили экспрессии монокристалла аксоновEcules в OSN.
Флуоресцентное иммуноокрашивание является распространенным методом визуализации экспрессии конкретных генов. Поскольку белки молекул, сортирующих аксоны, преимущественно локализованы для аксонов OSN, исследователям необходимо использовать секции OB для характеристики их выражений в OSN. Корональное разделение ОВ обычно использовалось для иммуноокрашивания. Однако этот препарат теряет топографическую информацию вдоль передней-задней оси в той же ОВ-секции. Поэтому мы разработали парасагиттальный препарат медиальной стороны ОВ, который может монтировать как можно больше окружающих клубочков на одном и том же участке ОВ. В сочетании с иммуноокрашиванием с использованием нескольких антител этот препарат позволяет сравнивать и анализировать образцы экспрессии молекул аксонов-сортировщиков без изменения окраски между участками ОВ.
Кроме того, иммуногистохимический метод окрашивания был представлен без постфиксирования с PFA aЙ сахарозы. Этот метод позволяет исследователям получать достаточное количество высококачественных данных о окрашивании для многопараметрического анализа данных. Представленные здесь протоколы предоставят подробную информацию о мощных методах для исследователей, изучающих формирование обонятельной нервной цепи.
Protocol
Representative Results
Discussion
Четырехкратное иммуноокрашивание парасегитальных ОВ-секций позволило визуализировать и количественно определять уровни экспрессии до четырех аксонобразующих молекул одновременно в большем числе клубочков. Анализируя эти многопараметрические данные с помощью СПС, можно предполож…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Фондом Мицубиси, Научным фондом Takeda, JST PRESTO и JSPS KAKENHI Grant Number 16H06144.
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?. Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
- Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
- Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
- Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
- Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
- Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
- Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
- Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
