Immunomarquage quadruple de l'ampoule olfactive pour la visualisation des codes d'identité moléculaire des axes sensoriels olfactifs
Summary
Les neurones sensoriels olfactifs expriment une grande variété de molécules de tri d'axones pour établir des circuits neuronaux appropriés. Ce protocole décrit une méthode de coloration immunohistochimique pour visualiser les expressions combinatoires des molécules de tri d'axones aux extrémités axonaires des neurones sensoriels olfactifs.
Abstract
Le système olfactif de souris est souvent utilisé pour étudier les mécanismes de formation de circuits neuronaux en raison de sa structure anatomique simple. Un neurone sensoriel olfactif (OSN) est une cellule bipolaire avec un seul dendrite et un seul axone non ramifié. Un OSN n'exprime qu'un seul gène de récepteur olfactif (OR), les OSN exprimant un type donné d'OR convergent leurs axones à quelques ensembles de glomérules invariants dans l'ampoule olfactive (OB). Une caractéristique remarquable de la projection OSN est que les OR exprimés jouent des rôles instructifs dans la projection axonale. Les ORs régulent l'expression de multiples molécules de tri d'axones et génèrent le code moléculaire combinatoire des molécules de tri d'axones à la terminaison axonale OSN. Ainsi, pour comprendre les mécanismes moléculaires des mécanismes de guidage de l'axone spécifiques à l'OR, il est essentiel de caractériser leurs profils d'expression au terminus de l'axone OSN dans le même glomérule. Le but de cet article était d'introduire des méthodes pour collecter autant de glomérules que possibleE sur une seule section OB et pour effectuer l'immunocoloration en utilisant plusieurs anticorps. Cela permettrait la comparaison et l'analyse des modèles d'expression des molécules de tri d'axones sans variation de coloration entre les sections OB.
Introduction
Pendant le développement, les neurones sont précisément connectés les uns aux autres pour former des circuits neuronaux appropriés, ce qui est essentiel pour la fonction cérébrale normale. Étant donné que les circuits neuronaux aberrants dans le cerveau sont considérés comme la cause de troubles mentaux tels que l'autisme et la schizophrénie, la compréhension des mécanismes de la formation de circuits neuronaux est l'un des principaux défis dans le domaine des neurosciences.
Dans le système olfactif de souris, chaque neurone sensoriel olfactif (OSN) dans l'épithélium olfactif (OE) exprime un seul gène de récepteur olfactif fonctionnel et les OSN exprimant le même OR convergent leurs axones à une paire spécifique de glomérules à des emplacements stéréotypés dans le Ampoule Olfactive (OB) 1 , 2 . Le système olfactif de souris est un excellent système modèle pour étudier les mécanismes moléculaires de la formation de circuits neuronaux parce que les chercheurs peuvent utiliser l'expression OR pour identifier une s spécifiqueUbtype des OSN et visualiser les sites de projection des axones OSN comme des structures glomérulaires claires. Une caractéristique remarquable de la projection OSN est que les OR jouent des rôles instructifs dans la projection des axones OSN à l'OB 3 , 4 , 5 , 6 . Plus précisément, après que les axones OSN sont guidés pour approximer les régions cibles, ils sont séparés pour former un glomérule de manière dépendant de l'OR. Des études antérieures ont montré que les molécules OR contrôlent l'expression des molécules de tri d'axones, qui régulent la ségrégation glomérulaire 7 , 8 . De plus, des preuves accumulées suggèrent que les molécules OR génèrent le code d'identité neuronal par une combinaison unique de molécules de tri axonal 9 . Ainsi, pour comprendre le mécanisme de la ségrégation glomérulaire dépendante de l'OR, il est nécessaire de caractériser les profils d'expression du moût de l'axoneDans les OSN.
L'immunocoloration fluorescente est une méthode commune pour visualiser l'expression de gènes spécifiques. Étant donné que les protéines des molécules de tri d'axones sont principalement localisées dans les axones OSN, les chercheurs doivent utiliser des sections OB pour caractériser leurs modèles d'expression dans les OSN. La sectionnement coronaire de l'OB a été habituellement utilisée pour l'immunocoloration. Cependant, cette préparation perd l'information topographique le long de l'axe antérieur-postérieur dans la même section OB. Nous avons donc développé une préparation parasagitique du côté médian de l'OB, qui peut monter autant de glomérules environnants que possible sur la même section OB. Combinée avec l'immunocoloration à l'aide d'anticorps multiples, cette préparation permet de comparer et d'analyser les profils d'expression des molécules de tri d'axones sans variation de coloration entre les sections OB.
En outre, une méthode de coloration immunohistochimique a été présentée sans post-fixation avec PFA aNd traitement au saccharose. Cette méthode permet aux chercheurs d'obtenir suffisamment de données de coloration de haute qualité pour une analyse de données multivariables. Les protocoles présentés ici fourniront des détails sur les méthodes puissantes pour les chercheurs qui étudient la formation du circuit neuronal olfactif.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'immunocoloration quadruple des sections OB parasagitales a permis de visualiser et de quantifier les niveaux d'expression jusqu'à quatre molécules de tri axones simultanément dans un plus grand nombre de glomérules. En analysant ces données multivariables avec PCA, les caractéristiques de l'expression de ces molécules peuvent être spéculées.
Pour une coloration réussie, la préparation des échantillons de tissu est d'une importance critique. Certains protoco…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation Mitsubishi, la Takeda Science Foundation, JST PRESTO et JSPS KAKENHI Numéro de subvention 16H06144.
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?. Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
- Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
- Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
- Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
- Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
- Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
- Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
- Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
