嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色
Summary
嗅覚ニューロンは、種々の軸索選別分子を発現して適切な神経回路を確立する。このプロトコルは、嗅覚ニューロンの軸索末端における軸索ソーティング分子のコンビナトリアル発現を視覚化する免疫組織化学的染色方法を記載している。
Abstract
マウスの嗅覚系は、単純な解剖学的構造のために神経回路形成のメカニズムを研究するためにしばしば用いられる。嗅覚ニューロン（OSN）は、単一の樹状突起および単一の分枝していない軸索を有する双極細胞である。 OSNは1つの嗅覚受容器（OR）遺伝子しか発現しないが、特定のタイプのORを発現するOSNは、嗅球（OB）の不変糸球体のいくつかのセットに軸索を収束させる。 OSN予測の顕著な特徴は、表現されたORが軸索投影において有益な役割を果たすことである。 ORは、複数の軸索選別分子の発現を調節し、OSN軸索末端に軸索選別分子のコンビナトリアル分子コードを生成する。したがって、OR特異的軸索誘導機構の分子機構を理解するためには、同じ糸球体内のOSN軸索末端での発現プロファイルを特徴付けることが重要である。この記事の目的は、可能な限り多くの糸球体を採取するための方法を紹介することでしたeを1つのOBセクションに、複数の抗体を用いて免疫染色を行うために使用します。これは、OB切片間の染色変異を伴わずに、軸索選別分子の発現パターンの比較および分析を可能にする。
Introduction
開発中、ニューロンは、正常な脳機能にとって重要な、適切な神経回路を形成するために相互に正確に接続される。脳の異常な神経回路は自閉症や統合失調症などの精神障害の原因であると考えられているため、神経回路形成のメカニズムを理解することは神経科学の分野における大きな課題の1つです。
マウス嗅覚系では、嗅覚上皮（OE）の各嗅覚ニューロン（OSN）は機能的な嗅覚受容器（OR）遺伝子を1つしか発現せず、同じORを発現するOSNは軸索を特定の糸球体対に収束させる。嗅球（OB） 1,2 。マウスの嗅覚系は、神経回路形成の分子メカニズムを研究するための優れたモデル系であり、研究者はOR発現を利用して特定のsOSNsのサブタイプを同定し、OSN軸索の投影部位を明確な糸球体構造として視覚化する。 OSN投影の顕著な特徴は、OSN軸索をOB 3、4、5、6に投影する際にORが有益な役割を果たすことである。より具体的には、OSN軸索が標的領域に近づくように誘導された後、それらは偏向されてOR依存的に糸球体を形成する。以前の研究では、OR分子が糸球体分離を調節する軸索選別分子の発現を制御することが示されている7,8 。さらに、蓄積している証拠は、OR分子が軸索選別分子のユニークな組み合わせによってニューロンの識別コードを生成することを示唆している9 。したがって、OR依存性糸球体分離のメカニズムを理解するためには、軸索選別モルの発現プロファイルを特徴付けることが必要であるOSNのecules。
蛍光免疫染色は、特定の遺伝子の発現を視覚化するための一般的な方法である。軸索選別分子のタンパク質は主にOSN軸索に局在するため、研究者はOSNの発現パターンを特徴づけるためにOB切片を使用する必要がある。 OBの冠状切片は免疫染色のために日常的に使用されている。しかし、この準備は、同じOBセクション内の前後軸に沿った地形情報を失う。したがって、我々はOBの内側の傍脊柱側枝の準備を開発しました。これは同じOBセクションにできるだけ多くの周囲の糸球体をマウントすることができます。複数の抗体を用いた免疫染色と組み合わせることにより、OB切片間の染色変異を伴わずに、軸索選別分子の発現パターンの比較および分析が可能になる。
さらに、免疫組織化学的染色方法が、PFAαスクロース処理。この方法により、研究者は多変量解析に十分な高品質の染色データを得ることができます。ここに提示されたプロトコルは、嗅覚神経回路形成を研究する研究者のための強力な方法の詳細を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
parasagittal OB切片の4回免疫染色により、より多くの糸球体において4つの軸索選別分子の発現レベルの視覚化および定量化が可能になった。これらの多変量データをPCAで分析することにより、これらの分子の発現の特徴を推測することができる。
染色を成功させるためには、組織試料の調製が非常に重要である。いくつかのプロトコルは、組織が4％PFAで後固定され、凍結?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、三菱財団、武田学術振興財団、JST PRESTO、学術振興会グラント番号16H06144の支援を受けました。
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?. Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
- Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
- Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
- Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
- Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
- Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
- Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
- Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
