Quadrupla Immunostaining della lampadina olfattiva per la visualizzazione di codici di identificazione molecolare Axon sensoriale olfattiva
Summary
I neuroni sensoriali olfattivi esprimono un'ampia varietà di molecole di selezione dell'assone per stabilire una corretta circuiteria neurale. Questo protocollo descrive un metodo di colorazione immunohistochemical per visualizzare le espressioni combinatorie delle molecole di selezione dell'assone all'estensione degli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi.
Abstract
Il sistema olfattivo del mouse è spesso utilizzato per studiare meccanismi di formazione dei circuiti neurali a causa della sua semplice struttura anatomica. Un neurone sensoriale olfattivo (OSN) è una cellula bipolare con un singolo dendrite e un singolo assone sfalsato. Un OSN esprime un solo gene del recettore olfattivo (OR), OSN che esprimono un determinato tipo di OR convergono i loro assoni a pochi insiemi di glomeruli invarianti nella lampadina olfattiva (OB). Una caratteristica notevole della proiezione OSN è che gli OR espressi svolgono ruoli istruttivi nella proiezione assonale. OR regolano l'espressione di molecole multiple di asson-sorting e generano il codice molecolare combinatorio delle molecole di smistamento dell'assone alle terminazioni axon OSN. Pertanto, per comprendere i meccanismi molecolari di meccanismi di orientamento dell'asse specifico OR, è fondamentale caratterizzare i loro profili di espressione ai termini axon OSN all'interno dello stesso glomerulo. Lo scopo di questo articolo è stato quello di introdurre metodi per la raccolta di tanti glomeruli come possibiliE su una singola sezione di OB e per l'esecuzione di immunostaining usando anticorpi multipli. Ciò consentirebbe il confronto e l'analisi dei modelli di espressione delle molecole di smistamento dell'assone senza la variazione di colorazione tra le sezioni OB.
Introduction
Durante lo sviluppo, i neuroni sono connessi tra loro per formare circuiti neurali appropriati, che sono fondamentali per la normale funzione cerebrale. Poiché i circuiti neurali aberranti nel cervello sono considerati la causa di disturbi mentali come l'autismo e la schizofrenia, la comprensione dei meccanismi di formazione dei circuiti neurali è una delle sfide più importanti nel campo della neuroscienza.
Nel sistema olfattivo del topo, ogni neurone sensoriale olfattivo (OSN) dell'Olteo olfattivo (OE) esprime un solo gene funzionale del recettore olfattivo (OR) e OSN che esprimono gli stessi OR convergono i propri assoni ad una coppia specifica di glomeruli in località stereotipate Olfactory Bulb (OB) 1 , 2 . Il sistema olfattivo del mouse è un eccellente sistema di modelli per studiare i meccanismi molecolari della formazione dei circuiti neurali, in quanto i ricercatori possono utilizzare l'espressione OR per identificare una specificaUbtype di OSN e visualizzare i siti di proiezione di assoni OSN come strutture chiare glomerulari. Una caratteristica notevole della proiezione OSN è che gli OR giocano ruoli istruttivi nel proiettare assoni OSN all'OB 3 , 4 , 5 , 6 . Più in particolare, dopo che gli assoni OSN vengono guidati per approssimare le regioni target, esse sono segregate per formare glomerulo in un modo OR dipendente. Studi precedenti hanno dimostrato che le molecole OR controllano l'espressione delle molecole di selezione dell'assone, che regolano la segregazione glomerulare 7 , 8 . Inoltre, l'accumulo di prove suggerisce che le molecole OR generano il codice di identità neuronale da una combinazione unica di molecole d'asson-sorting 9 . Pertanto, per comprendere il meccanismo della segregazione glomerulare dipendente da OR, è necessario caratterizzare i profili di espressione di molEcules in OSNs.
L'immunostaining fluorescente è un metodo comune per visualizzare l'espressione di geni specifici. Poiché le proteine delle molecole di selezione dell'assone sono prevalentemente localizzate agli assoni OSN, i ricercatori devono utilizzare le sezioni OB per caratterizzare i loro pattern di espressione in OSN. La sezionatura coronale dell'OB è stata utilizzata abitualmente per l'immunostaining. Tuttavia, questo preparato perde le informazioni topografiche lungo l'asse anteriore-posteriore nella stessa sezione OB. Abbiamo quindi sviluppato una preparazione parasagittale del lato mediale dell'OB, che può montare il maggior numero possibile di glomeruli circostanti sulla stessa sezione OB. Combinata con immunostaining utilizzando anticorpi multipli, questa preparazione consente il confronto e l'analisi dei pattern di espressione delle molecole di smistamento dell'assone senza la variazione di colorazione tra le sezioni OB.
Inoltre, un metodo di colorazione immunohistochemica è stato presentato senza post-fissazione con PFA aIl trattamento con saccarosio. Questo metodo consente ai ricercatori di ottenere sufficienti dati di colorazione di alta qualità per l'analisi dei dati multivariabili. I protocolli qui presentati forniranno dettagli di potenti metodi per i ricercatori che studiano la formazione del circuito neurale olfattivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'immunostaining quadruple delle sezioni OB parasagittali ha permesso la visualizzazione e la quantificazione dei livelli di espressione di ben quattro molecole di selezione dell'assone contemporaneamente in un numero maggiore di glomeruli. Analizzando questi dati multivariabili con PCA, le caratteristiche per l'espressione di queste molecole possono essere speculate.
Per una colorazione efficace, la preparazione del campione di tessuti è di importanza cruciale. Alcuni protocoll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Mitsubishi, dalla Fondazione di Scienza di Takeda, da JST PRESTO e da JSPS KAKENHI di Grant Number 16H06144.
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
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