Viervoudige Immunostaining van de Olfactorische Lamp voor Visualisatie van Olfactorische Sensorische Axon Moleculaire Identiteitscodes
Summary
Olfactorische zintuiglijke neuronen vormen een grote verscheidenheid aan axon-sorterende moleculen om een goede neurale schakeling te vormen. Dit protocol beschrijft een immunohistochemische kleuring methode om combinatorische expressies van axon-sorterende moleculen te visualiseren bij de axon termini van olfactorische sensorische neuronen.
Abstract
Het muisolfactorische systeem wordt vaak gebruikt om mechanismen van neurale circuitvorming te bestuderen door zijn eenvoudige anatomische structuur. Een Olfactory Sensory Neuron (OSN) is een bipolaire cel met een enkel dendriet en een enkele onbewerkte axon. Een OSN expresseert slechts één Olfactor Receptor (OR) gen, OSN's die een bepaald type OR uitdrukken, convergeren hun axonen naar een paar sets van invariant glomeruli in de Olfactory Bulb (OB). Een opvallend kenmerk van OSN-projectie is dat de uitgedrukte OR's instructieve rollen spelen in axonale projectie. OR's regelen de expressie van meerdere axon-sorteermoleculen en genereren de combinatorische moleculaire code van axon-sorteermoleculen bij de OSN axon termini. Om de moleculaire mechanismen van OR-specifieke axonbegeleidingsmechanismen te begrijpen is het daarom van vitaal belang om hun expressieprofielen op de OSN axon termini te identificeren binnen dezelfde glomerulus. Het doel van dit artikel was om methoden voor het verzamelen van zoveel glomeruli als mogelijk te introducerenE op een enkele OB-sectie en voor het verrichten van immunostaining met behulp van meerdere antilichamen. Dit zou de vergelijking en analyse van de expressiepatronen van axon-sorterende moleculen mogelijk maken zonder kleurvariatie tussen OB-secties te verklaren.
Introduction
Tijdens de ontwikkeling zijn neuronen precies verbonden met elkaar om de juiste neurale circuits te vormen, die kritiek is voor de normale hersenfunctie. Aangezien afwijkende neurale circuits in de hersenen vermoedelijk de oorzaak zijn van psychische stoornissen zoals autisme en schizofrenie, is het begrip van de mechanismen van neurale circuitvorming een van de belangrijkste uitdagingen op het gebied van neurowetenschappen.
In het olfactorische systeem van de muis vertoont elke Olfactory Sensory Neuron (OSN) in het Olfactory Epithelium (OE) slechts één functioneel Olfactor Receptor (OR) gen en OSN's die hetzelfde uitdrukken of hun axonen convergeren naar een specifiek paar glomeruli op stereotiepe locaties in de Olfactory Bulb (OB) 1 , 2 . Het muisolfactorische systeem is een uitstekend model systeem voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van neurale circuitvorming omdat onderzoekers de OR-expressie kunnen gebruiken om een specifieke s te identificerenUbtype van OSN's en visualiseer de projectiesites van OSN axons als duidelijke glomerulaire structuren. Een opvallend kenmerk van OSN-projectie is dat OR's instructieve rollen spelen bij het projecteren van OSN-axons naar de OB 3 , 4 , 5 , 6 . Meer specifiek, nadat OSN-axonen worden geleid om de doelgebied te benaderen, worden ze gescheiden om glomerulus op een OR-afhankelijke manier te vormen. Vorige onderzoeken hebben aangetoond dat OR moleculen de expressie van axon-sorterende moleculen regelen, die glomerulaire segregatie 7 , 8 regelen. Bovendien suggereert accumulerende bewijs dat OR moleculen de neuronale identiteitscode genereren door een unieke combinatie van axon-sorterende moleculen 9 . Om het mechanisme van OR-afhankelijke glomerulaire segregatie te begrijpen, is het daarom nodig om de expressieprofielen van axon-sorterende moleculen te karakteriserenEcules in OSN's.
Fluorescerende immunostaining is een gebruikelijke methode om de expressie van specifieke genen te visualiseren. Aangezien eiwitten van axon-sorterende moleculen overwegend gelokaliseerd zijn aan OSN-axonen, moeten onderzoekers OB-afdelingen gebruiken om hun expressiepatronen in OSN's te karakteriseren. Coronale doorsnede van de OB is routinematig gebruikt voor immunostaining. Deze voorbereiding verliest echter de topografische informatie langs de voor- en achterste as in dezelfde OB-sectie. We ontwikkelden daarom een parasagittale voorbereiding van de mediale zijde van de OB, die zo veel mogelijk glomeruli op de zelfde OB-sectie kan monteren. Gecombineerd met immunostaining met behulp van meerdere antilichamen, maakt dit preparaat de vergelijking en analyse van de expressiepatronen van axon-sorterende moleculen zonder kleursvariatie tussen OB-secties mogelijk.
Verder is een immunohistochemische kleuring methode gepresenteerd zonder postfixatie met PFA aEn sucrose behandeling. Met deze methode kunnen onderzoekers voldoende kwalitatief goede kleurdata verkrijgen voor multivariabele data-analyse. De hier beschreven protocollen geven details van krachtige methoden voor onderzoekers die de olfactieve neurale kringvorming bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Viervoudige immunostaining van parasagittale OB-secties heeft de visualisatie en kwantificering van de expressieniveaus van maximaal vier axon-sorteermoleculen gelijktijdig mogelijk gemaakt in een groter aantal glomeruli. Door deze multivariabele gegevens te analyseren met PCA kunnen de kenmerken voor de expressie van die moleculen gespeculeerd worden.
Voor succesvolle kleuring is het weefselmonsterbereiding kritisch belangrijk. Sommige protocollen suggereren dat weefsels moeten worden vastg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Mitsubishi Foundation, de Takeda Science Foundation, JST PRESTO en JSPS KAKENHI Grant Number 16H06144.
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?. Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
- Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
- Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
- Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
- Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
- Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
- Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
- Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
