رباعية المناعية من لمبة الشمية لتصور رموز حسية أكسون الجزيئية الحسية
Summary
الخلايا العصبية الحسية الشمية تعبر عن مجموعة واسعة من جزيئات محوار الفرز لإنشاء الدوائر العصبية المناسبة. يصف هذا البروتوكول طريقة تلطيخ المناعية لتصور التعبيرات كومبيناتوريال من جزيئات الفرز محوار في تيرميني محور عصبي من الخلايا العصبية الحسية الشم.
Abstract
وغالبا ما يستخدم نظام الشمية الماوس لدراسة آليات تشكيل الدائرة العصبية بسبب هيكل تشريحي بسيط لها. الخلايا العصبية الحسية الشمية (أوسن) هي خلية ثنائية القطب مع دندريت واحد و محور عصبي واحد أونبرانشد. وتعبر أوسن عن جينة واحدة فقط من مستقبلات أولفاكتوري (أور)، أوسنز تعبر عن نوع معين من أور تتلاقى محاورها مع بضع مجموعات من الكبيبات الثابتة في لمبة الشم (أوب). وهناك ميزة ملحوظة من إسقاط أوسن هو أن أورس أعرب لعب الأدوار مفيدة في الإسقاط محور عصبي. أورس تنظم التعبير عن جزيئات محورية الفرز متعددة وتوليد رمز الجزيئي كومبيناتوريال من جزيئات الفرز محوار في تيرميني محور أوسن. وهكذا، لفهم الآليات الجزيئية لآليات التوجيه محور عصبي أور، فمن الأهمية بمكان لتوصيف ملامح التعبير في تيرميني محور أوسن داخل الكبيبة نفسها. والهدف من هذه المقالة هو إدخال أساليب لجمع أكبر عدد ممكن من الكبيبات كما بوسيبله على قسم أوب واحد وأداء إمونوستينينغ باستخدام الأجسام المضادة متعددة. وهذا من شأنه أن يسمح للمقارنة وتحليل أنماط التعبير من جزيئات الفرز محوار دون تلطيخ التباين بين أقسام أوب.
Introduction
خلال التنمية، ترتبط الخلايا العصبية على وجه التحديد مع بعضها البعض لتشكيل الدوائر العصبية المناسبة، وهو أمر حاسم لوظيفة الدماغ العادية. منذ الدوائر العصبية الشاذة في الدماغ ويعتقد أن يكون سبب الاضطرابات النفسية مثل التوحد والفصام، فهم آليات تشكيل الدوائر العصبية هي واحدة من التحديات الرئيسية في مجال علم الأعصاب.
في نظام الشمي الماوس، كل الخلايا العصبية الحسية الشم (أوسن) في ظهارة الشمية (أو) يعبر عن واحد فقط الجينات مستقبلات الشفة (أور) و أوسنز التعبير عن نفس أو تلاقى محاورها لزوج معين من الكبيبات في مواقع نمطية في اللمبة الشمية (أوب) 1 ، 2 . نظام شمي الماوس هو نظام نموذج ممتاز لدراسة الآليات الجزيئية لتشكيل الدائرة العصبية لأن الباحثين يمكن الاستفادة من التعبير أو لتحديد ق محددةأوبتيون من أوسنز وتصور مواقع الإسقاط من المحاور أوسن كما هياكل كبيبي واضح. وهناك ميزة ملحوظة من إسقاط أوسن هو أن أورس تلعب الأدوار مفيدة في إسقاط محاور أوسن إلى أوب 3 ، 4 ، 5 ، 6 . وبشكل أكثر تحديدا، بعد توجيه محاور أوسن إلى المناطق المستهدفة التقريبية، يتم فصلها لتشكيل الكبيبات بطريقة تعتمد على أور. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن جزيئات أور السيطرة على التعبير عن جزيئات الفرز محوار، التي تنظم الفصل الكبيبي 7 ، 8 . وعلاوة على ذلك، تشير الأدلة المتراكمة إلى أن جزيئات أور تولد رمز هوية الخلايا العصبية بواسطة مزيج فريد من جزيئات الفرز المحوري 9 . وهكذا، لفهم آلية فصل الكبيبي أو تعتمد، فمن الضروري لتوصيف ملامح التعبير من محوار فرز مولإيكولز في أوسنز.
المناعية الفلورسنت هو طريقة شائعة لتصور التعبير عن جينات محددة. منذ البروتينات من جزيئات محوار الفرز هي في الغالب المترجمة إلى محاور أوسن، يحتاج الباحثون إلى استخدام أقسام أوب لتوصيف أنماط التعبير في أوسنز. وقد تم استخدام الاقسام كورونال من أوب بشكل روتيني للمناعية. ومع ذلك، فإن هذا الإعداد يفقد المعلومات الطبوغرافية على طول المحور الأمامي الخلفي في نفس القسم أوب. ولذلك وضعنا إعداد باراساجيتال من الجانب الإنسي من أوب، والتي يمكن تحميل العديد من الكبيبات المحيطة ممكن على نفس القسم أوب. جنبا إلى جنب مع إمونوستينينغ باستخدام الأجسام المضادة متعددة، وهذا التحضير يسمح للمقارنة وتحليل أنماط التعبير من جزيئات الفرز محوار دون تلطيخ التباين بين أقسام أوب.
وعلاوة على ذلك، تم تقديم طريقة تلطيخ المناعية دون تثبيت بعد مع بفا أند العلاج السكروز. هذه الطريقة تسمح للباحثين الحصول على ما يكفي من البيانات تلطيخ عالية الجودة لتحليل البيانات متعددة المتغيرات. البروتوكولات المقدمة هنا سوف توفر تفاصيل أساليب قوية للباحثين الذين يدرسون تشكيل الدائرة العصبية الشمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمكنت المناعية رباعية من أقسام أوب باراساجيتال التصور والتقدير الكمي لمستويات التعبير من ما يصل إلى أربعة جزيئات محوار الفرز في وقت واحد في عدد أكبر من الكبيبات. من خلال تحليل هذه البيانات متعددة المتغيرات مع يكا، يمكن التكهن بخصائص التعبير عن تلك الجزيئات.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ميتسوبيشي، ومؤسسة تاكيدا للعلوم، جست بريستو و جسبس كاكينهي رقم المنحة 16H06144.
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?. Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
- Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
- Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
- Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
- Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
- Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
- Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
- Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
