Imunossinção Quadruple da Lâmpada Olfativa para Visualização de Códigos de Identidade Molecular de Axon Sensorial Olfativo
Summary
Os neurônios sensoriais olfatórios expressam uma grande variedade de moléculas de classificação axônica para estabelecer circuitos neurais adequados. Este protocolo descreve um método de coloração imuno-histoquímica para visualizar expressões combinatórias de moléculas de ordenação axônica no terminal axônico de neurônios sensoriais olfativos.
Abstract
O sistema olfativo do mouse é freqüentemente usado para estudar mecanismos de formação de circuitos neurais devido à sua estrutura anatômica simples. Um Neurônio Sensorial Olfatório (OSN) é uma célula bipolar com um único dendrito e um único axônio não derivado. Um OSN expressa apenas um gene de receptor olfatório (OR), OSNs que expressam um determinado tipo de OR convergem seus axônios para alguns conjuntos de glomérulos invariantes no bulbo olfatório (OB). Uma característica notável da projeção de OSN é que as OU expressadas desempenham papéis instrutivos na projeção axonal. As ORs regulam a expressão de múltiplas moléculas de classificação axônica e geram o código molecular combinatório de moléculas de classificação de axônio no terminal axônico OSN. Assim, para entender os mecanismos moleculares dos mecanismos de orientação axônica OR específicos, é vital caracterizar seus perfis de expressão no terminal axônico OSN dentro do mesmo glomérulo. O objetivo deste artigo foi introduzir métodos para coletar tantos glomeruli como possiblE em uma única seção de OB e para realizar imunocoloração usando múltiplos anticorpos. Isso permitiria a comparação e análise dos padrões de expressão de moléculas de classificação de axônio sem variação de coloração entre seções de OB.
Introduction
Durante o desenvolvimento, os neurônios estão precisamente conectados uns aos outros para formar circuitos neurais adequados, o que é crítico para a função normal do cérebro. Uma vez que os circuitos neurais aberrantes no cérebro são pensados para ser a causa de transtornos mentais, como autismo e esquizofrenia, a compreensão dos mecanismos de formação de circuitos neurais é um dos principais desafios no campo da neurociência.
No sistema olfativo do mouse, cada Neurônio Sensorial Olfativo (OSN) no Epitelio Olfatório (OE) expressa apenas um gene funcional do Receptor Olfativo (OR) e OSNs expressando o mesmo OR convergem seus axônios para um par específico de glomérulos em locais estereotipados no Bulbo Olfativo (OB) 1 , 2 . O sistema olfativo do mouse é um excelente modelo de sistema para estudar os mecanismos moleculares da formação de circuitos neurais porque os pesquisadores podem utilizar a expressão OR para identificar um específico sUbtype de OSNs e visualizar os sites de projeção de axônios de OSN como estruturas glomerulares claras. Uma característica notável da projeção OSN é que as RUP desempenham papéis instrutivos na projeção de axônios OSN para o OB 3 , 4 , 5 , 6 . Mais especificamente, após os axônios do OSN serem orientados para aproximar as regiões alvo, eles são segregados para formar glomérulos de forma dependente de OR. Estudos anteriores mostraram que as moléculas de OR controlam a expressão de moléculas de triagem de axônio, que regulam a segregação glomerular 7 , 8 . Além disso, as evidências acumuladas sugerem que as moléculas de OR geram o código de identidade neuronal por uma combinação única de moléculas de classificação axônica 9 . Assim, para entender o mecanismo de segregação glomerular dependente de OR, é necessário caracterizar os perfis de expressão do mol de ordenação axônicaEcules em OSNs.
A imunocoloração fluorescente é um método comum para visualizar a expressão de genes específicos. Uma vez que as proteínas das moléculas de triagem axônica estão predominantemente localizadas em axônios OSN, os pesquisadores precisam usar seções OB para caracterizar seus padrões de expressão em OSNs. O corte coronal do OB foi rotineiramente utilizado para imunomarcação. No entanto, esta preparação perde a informação topográfica ao longo do eixo anterior-posterior na mesma seção de OB. Desta forma, desenvolvemos uma preparação parasagital do lado medial do OB, que pode montar tantos glomerulis circundantes quanto possível na mesma seção de OB. Combinado com imunomarcação com múltiplos anticorpos, esta preparação permite a comparação e análise dos padrões de expressão de moléculas de triagem de axônio sem variação de coloração entre seções de OB.
Além disso, um método de coloração imuno-histoquimica foi apresentado sem pós-fixação com PFA aE tratamento de sacarose. Este método permite aos pesquisadores obter dados suficientes de coloração de alta qualidade para análise de dados multivariáveis. Os protocolos aqui apresentados fornecerão detalhes de métodos poderosos para pesquisadores que estudam a formação de circuitos neurais olfativos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A imunotinção quádrupla das seções de parasagittal OB possibilitou a visualização e quantificação dos níveis de expressão de até quatro moléculas de triagem de axônio simultaneamente em um maior número de glomérulos. Ao analisar esses dados multivariáveis com PCA, as características para a expressão dessas moléculas podem ser especuladas.
Para a coloração bem sucedida, a preparação da amostra de tecido é extremamente importante. Alguns protocolos sugerem que os…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Mitsubishi, a Takeda Science Foundation, JST PRESTO e JSPS KAKENHI Grant Number 16H06144.
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
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