Quadruple Immunostaining av Olfactory Bulb for Visualisering av Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes
Summary
Olfaktoriske sensoriske nevroner uttrykker et bredt utvalg av akson-sorteringsmolekyler for å etablere riktig neural kretsløp. Denne protokollen beskriver en immunhistokjemisk fargemetode for å visualisere kombinatoriske uttrykk for akson-sorteringsmolekyler ved axonterminalene til olfaktoriske sensoriske nevroner.
Abstract
Muselaktiveringssystemet brukes ofte til å studere mekanismer for neurale kretsdannelser på grunn av sin enkle anatomiske struktur. En Olfactory Sensory Neuron (OSN) er en bipolar celle med en enkelt dendrit og en enkelt unbranched axon. Et OSN uttrykker bare ett Olfaktorisk Receptor (OR) -gen, OSN som uttrykker en gitt type OR, konvergerer deres axoner til et par sett med invariant glomeruli i Olfactory Bulb (OB). Et bemerkelsesverdig trekk ved OSN-projeksjon er at de uttrykte OR-er spiller lærerikt roller i aksonal projeksjon. ORer regulerer uttrykket for flere akson-sorteringsmolekyler og genererer den kombinatoriske molekylekoden for akson-sorteringsmolekyler ved OSN axon termini. For å forstå de molekylære mekanismene til OR-spesifikke axon-styringsmekanismer, er det derfor viktig å karakterisere uttrykksprofiler på OSN axon termini innenfor samme glomerulus. Formålet med denne artikkelen var å introdusere metoder for å samle så mange glomeruli som muligE på en enkelt OB-seksjon og for å utføre immunfarvning ved bruk av flere antistoffer. Dette ville tillate sammenligning og analyse av ekspressionsmønstrene av akson-sorteringsmolekyler uten fargevariasjon mellom OB-seksjoner.
Introduction
Under utvikling er nevroner nettopp forbundet med hverandre for å danne skikkelige nevrale kretser, noe som er kritisk for normal hjernefunksjon. Siden avvikende nevrale kretser i hjernen antas å være årsaken til psykiske lidelser som autisme og schizofreni, er forståelsen av mekanismer for nevralkretsdannelse en av de store utfordringene innen nevrovitenskap.
I det museolfaktoriske systemet uttrykker hver Olfactory Sensory Neuron (OSN) i Olfactory Epithelium (OE) bare ett funksjonelt olfaktorisk reseptor (OR) -gen og OSN som uttrykker det samme OR konvergerer deres axoner til et bestemt par glomeruli på stereotype steder i Olfactory Bulb (OB) 1 , 2 . Muselaktiveringssystemet er et utmerket modellsystem for å studere molekylære mekanismer for dannelsen av neural krets fordi forskere kan benytte OR uttrykket til å identifisere en bestemt sUbtype av OSN og visualisere projeksjonsstedene til OSN-axoner som klare glomerulære strukturer. Et bemerkelsesverdig trekk ved OSN-projeksjon er at ORer spiller instruerende roller i å projisere OSN-axoner til OB 3 , 4 , 5 , 6 . Nærmere bestemt, etter at OSN-axoner er veiledet til omtrentlige målområder, blir de segregert for å danne glomerulus på en OR-avhengig måte. Tidligere studier har vist at OR molekyler styrer uttrykket for akson-sorteringsmolekyler, som regulerer glomerulær segregering 7 , 8 . Videre antyder akkumulerende bevis at OR-molekyler genererer den neuronale identitetskoden ved en unik kombinasjon av akson-sorteringsmolekyler 9 . For å forstå mekanismen for OR-avhengig glomerulær segregering er det derfor nødvendig å karakterisere uttrykksprofilene for akson-sortering molEcules i OSNs.
Fluorescerende immunfarging er en vanlig metode for å visualisere uttrykket av bestemte gener. Siden proteiner av akson-sorteringsmolekyler overveiende er lokalisert til OSN-axoner, må forskere bruke OB-seksjoner til å karakterisere deres uttrykksmønstre i OSN-er. Koronalt snitt av OB har blitt rutinemessig brukt til immunfarging. Imidlertid mister dette preparatet den topografiske informasjonen langs den fremre og bakre akse i samme OB-seksjon. Vi utviklet derfor et parasagittalt preparat av OB-medialsiden, som kan montere så mange omgivende glomeruli som mulig på den samme OB-delen. Kombinert med immunfarging ved bruk av flere antistoffer tillater dette preparatet sammenligning og analyse av ekspressionsmønstrene av akson-sorteringsmolekyler uten farging av variasjon mellom OB-seksjoner.
Videre er en immunohistokjemisk fargemetode blitt presentert uten post-fiksering med PFA aOg sukrosebehandling. Denne metoden tillater forskere å skaffe tilstrekkelig fargedata av høy kvalitet for multivariabel dataanalyse. Protokollene som presenteres her, vil gi detaljer om kraftige metoder for forskere som studerer den olfaktoriske nevrale kretsdannelsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Firemanns immunostaining av parasagittale OB-seksjoner aktiverte visualiseringen og kvantifiseringen av ekspressionsnivåene av så mange som fire akson-sorteringsmolekyler samtidig i et større antall glomeruli. Ved å analysere disse multivariable dataene med PCA kan egenskapene for ekspresjonen av disse molekylene spekuleres.
For vellykket farging er vevsprøvepreparatet kritisk viktig. Noen protokoller tyder på at vev skal settes fast med 4% PFA og behandles med 30% sukrose for kryobesk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Mitsubishi Foundation, Takeda Science Foundation, JST PRESTO og JSPS KAKENHI Grant Number 16H06144.
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?. Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
- Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
- Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
- Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
- Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
- Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
- Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
- Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
