Quadruple Immunostaining av Olfactory Bulb för Visualisering av Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes
Summary
Olfaktoriska sensoriska neuroner uttrycker ett brett utbud av axon-sorteringsmolekyler för att upprätta en lämplig neuralkrets. Detta protokoll beskriver en immunohistokemisk färgmetod för att visualisera kombinatoriska uttryck av axonsorteringsmolekyler vid axonterminalerna av olfaktoriska sensoriska neuroner.
Abstract
Muselektriskt system används ofta för att studera mekanismer för neuralkretsbildning på grund av dess enkla anatomiska struktur. En olfaktorisk sensorisk neuron (OSN) är en bipolär cell med en enda dendrit och en enda orörd axon. En OSN uttrycker endast en olfaktorisk receptor (OR) -gen, OSN som uttrycker en given typ av OR konvergerar sina axoner till några uppsättningar av invariant glomeruli i olfaktorisk lampa (OB). Ett anmärkningsvärt inslag i OSN-projektionen är att de uttryckta ORsna spelar lärorika roller i axonal projicering. OR: er reglerar uttrycket för multipla axon-sorteringsmolekyler och genererar den kombinatoriska molekylärkoden för axonsorteringsmolekyler vid OSN axon termini. För att förstå de molekylära mekanismerna för OR-specifika axonstyrningsmekanismer är det därför nödvändigt att karakterisera deras expressionsprofiler vid OSN axon termini inom samma glomerulus. Syftet med denna artikel var att införa metoder för att samla in så många glomeruli som möjligtE på en enda OB-sektion och för att utföra immunfärgning med användning av flera antikroppar. Detta skulle möjliggöra jämförelse och analys av uttrycksmönstren för axonsorteringsmolekyler utan färgningsvariation mellan OB-sektioner.
Introduction
Under utveckling är neuroner exakt kopplade till varandra för att bilda korrekta neurala kretsar, vilket är kritiskt för normal hjärnfunktion. Eftersom avvikande neurala kretsar i hjärnan anses vara orsaken till psykiska störningar som autism och schizofreni är förståelsen av mekanismerna för neuralkretsbildning en av de största utmaningarna inom neurovetenskap.
I det olfaktiva systemet i musen uttrycker varje Olfactory Sensory Neuron (OSN) i Olfactory Epithelium (OE) endast en funktionell olfaktorreceptor (OR) -gen och OSN som uttrycker samma ELLER konvergerar sina axoner till ett visst par glomeruli på stereotypa platser i Olfaktorisk lampa (OB) 1 , 2 . Musolftaktivt system är ett utmärkt modellsystem för att studera molekylära mekanismer för neuralkretsbildning eftersom forskare kan använda OR-uttrycket för att identifiera en specifik sUbtype av OSN och visualisera projektionsställen för OSN-axoner som klara glomerulära strukturer. Ett anmärkningsvärt inslag i OSN-projiceringen är att ORs spelar lärorika roller vid utskjutande OSN-axoner till OB 3 , 4 , 5 , 6 . Närmare bestämt, efter att OSN-axonerna riktas till approximativa målregioner, är de segregerade för att bilda glomerulus på ett OR-beroende sätt. Tidigare studier har visat att OR-molekyler kontrollerar uttrycket av axonsorteringsmolekyler, som reglerar glomerulär segregering 7 , 8 . Vidare föreslår ackumulerande bevis att OR-molekyler alstrar den neuronala identitetskoden med en unik kombination av axonsorteringsmolekyler 9 . För att förstå mekanismen för OR-beroende glomerulär segregering är det således nödvändigt att karakterisera expressionsprofilerna för axonsorterings-molEcules i OSN.
Fluorescerande immunförstärkning är en vanlig metod för att visualisera uttrycket av specifika gener. Eftersom proteiner av axonsorteringsmolekyler är övervägande lokaliserade till OSN-axoner, måste forskare använda OB-sektioner för att karakterisera deras uttrycksmönster i OSN. Koronavsnittning av OB har rutinmässigt använts för immunostaining. Emellertid förlorar denna beredning den topografiska informationen längs den främre-bakre axeln i samma OB-sektion. Vi utvecklade därför en parasagittalberedning av OB-medialsidan, som kan montera så många omgivande glomeruli som möjligt på samma OB-sektion. Kombinerad med immunfärgning med användning av multipla antikroppar möjliggör denna beredning jämförelse och analys av expressionsmönstren hos axonsorteringsmolekyler utan färgningsvariation mellan OB-sektioner.
Vidare har en immunohistokemisk färgningsmetod presenterats utan postfixering med PFA aOch sackarosbehandling. Med den här metoden kan forskare få tillräckligt med färgdata för hög kvalitet för multivariabel dataanalys. De protokoll som presenteras här kommer att ge detaljer om kraftfulla metoder för forskare som studerar den olfaktoriska neurala kretsbildningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fyrfaldig immunförstärkning av parasagittala OB-sektioner möjliggjorde visualisering och kvantifiering av expressionsnivåerna av så många som fyra axon-sorterande molekyler samtidigt i ett större antal glomeruli. Genom att analysera dessa multivariabla data med PCA kan egenskaperna för uttrycket av dessa molekyler spekuleras.
För framgångsrik färgning är vävnadsprovberedningen kritisk viktig. Några protokoll tyder på att vävnaderna ska efterföras med 4% PFA och behandlas med…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Mitsubishi Foundation, Takeda Science Foundation, JST PRESTO och JSPS KAKENHI Grant Number 16H06144.
Materials
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH7.4 | TAKARA BIO | T9181 | |
| Skim Milk | nacalai tesque | 31149-75 | |
| goat anti-Sema7A antibody | R&D Systems | AF2068 | |
| rat anti-OLPC antibody | Merck Millipore | MABT20 | |
| mouse anti-VGLUT2 antibody | Merck Millipore | MAB5504 | |
| goat anti-BIG-2 antibody | R&D Systems | AF2205 | |
| gunea pig anti-Kirrel2 antibody | Operon Biotechnologies | Anti-Kirrel2 antibodies were generated by immunizing guinea pigs with KLH-conjugated synthetic peptides (644-673aa): CRLYRARAGYLTTPHPRAFTSYMKPTSFGP | |
| donkey anti-mouse Alexa Fluor 405 | Abcam | ab175658 | |
| donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| donkey anti-guinea pig Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A21432 | |
| donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 712-605-153 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| MAS coated slide glasses | MATSUNAMI | MAS-01 | |
| forceps | Fine Science Tools | 11253-27 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| dissecting scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X700 | |
| DAPI filter cube | KEYENCE | OP-87762 | |
| GFP filter cube | KEYENCE | OP-87763 | |
| TRITC filter cube | KEYENCE | OP-87764 | |
| Cy5 filter cube | KEYENCE | OP-87766 | |
| filter paper | ADVANTEC | 00011185 | |
| O.C.T compound | Sakura Finetek | M71484 |
References
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain?. Annu Rev Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- Takeuchi, H., Sakano, H. Neural map formation in the mouse olfactory system. Cell Mol Life Sci. 71, 3049-3057 (2014).
- Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87, 675-686 (1996).
- Feinstein, P., Mombaerts, P. A contextual model for axonal sorting into glomeruli in the mouse olfactory system. Cell. 117, 817-831 (2004).
- Ishii, T., et al. Monoallelic expression of the odourant receptor gene and axonal projection of olfactory sensory neurones. Genes Cell. 6, 71-78 (2001).
- Nakashima, A., et al. Agonist-independent GPCR activity regulates anterior-posterior targeting of olfactory sensory neurons. Cell. 154, 1314-1325 (2013).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127, 1057-1069 (2006).
- Kaneko-Goto, T., Yoshihara, S., Miyazaki, H., Yoshihara, Y. BIG-2 mediates olfactory axon convergence to target glomeruli. Neuron. 57, 834-846 (2008).
- Ihara, N., Nakashima, A., Hoshina, N., Ikegaya, Y., Takeuchi, H. Differential expression of axon-sorting molecules in mouse olfactory sensory neurons. Eur J Neuro. 44, 1998-2003 (2016).
- Williams, E. O., et al. Delta Protocadherin 10 is Regulated by Activity in the Mouse Main Olfactory System. Front Neural Circuits. 5, 9 (2011).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
