Tot oprichting van dubbele weerstand tegen EGFR-TKI en ONTMOETTE-TKI in Lung adenocarcinoom cellen In Vitro met een 2-step dosis-escalatie-Procedure
Summary
Een in vitro -methode voor de vaststelling van dubbele weerstand tegen een EGFR-TKI en een BMO-TKI in kankercellen wordt beschreven. Deze methode is handig voor het ontwikkelen van behandelingen voor patiënten met EGFR-mutaties, die de progressie van de ziekte ondanks EGFR-TKI behandeling met BMO-amplificatie vertonen. Het kan ook worden gewijzigd voor remmers gericht op andere moleculen.
Abstract
Resistentie is een grote uitdaging in kankertherapie. De generatie van resistente sublijnen in vitro is noodzakelijk voor het ontdekken van nieuwe mechanismen te overwinnen van deze uitdaging. Hier, een 2-step dosis-escalatie-methode voor de vaststelling van dual-weerstand tegen een epidermale groeifactor receptor (EGFR)-tyrosine kinase inhibitor (TKI), gefitinib en een BMO-TKI, PHA665752, wordt beschreven. Deze methode is gebaseerd op eenvoudige stapsgewijze dosis-escalatie van remmers voor inducerende verworven resistentie bij cellijnen. De alternatieve methode voor het genereren van resistente sublijnen gaat bloot van de cellen aan hoge concentraties van de Inhibitor van de omwenteling in één stap. De stapsgewijze dosis-escalatie-methode heeft een hogere mogelijkheidom succesvol inducerende verworven weerstand dan deze methode. Activeren van de EGFR zijn mutaties biomarkers voor een reactie op behandeling met EGFR-TKI, dat is een toegepaste eerstelijnsbehandeling voor niet-kleincellige longkanker kanker (NKCLK), die deze mutaties haven. Ondanks berichten van doeltreffend antwoord wordt geformuleerd is het gebruik van EGFR-TKI echter beperkt omdat tumoren onvermijdelijk resistentie verwerven. De belangrijkste mechanismen achter EGFR-TKI weerstand omvatten een secundaire mutatie op de site van de gatekeeper, T790M in exon 20 van EGFR en een signaal van de rondweg van BMO. Dus, zou een mogelijke oplossing voor dit probleem een combinatie van EGFR-TKI en BMO-TKI. Deze gecombineerde behandeling blijkt effectief te zijn in een in vitro studie model. Verworven gefitinib-resistentie opgericht door BMO-amplificatie door stapsgewijze dosis-escalatie van gefitinib voor 12 maanden en een cellijn met de naam PC-9MET1000 werd gemaakt in een eerdere studie. Voor het verder onderzoek naar de mechanismen van verworven BMO-TKI en EGFR-TKI werd weerstand, een BMO-TKI, PHA665752, toegediend aan deze cellen met stapsgewijze dosis-escalatie in aanwezigheid van gefitinib voor 12 maanden. Dit protocol heeft ook met succes toegepast voor een aantal combinatie therapieën om verworven weerstand tegen andere moleculen van de Inhibitor van de omwenteling.
Introduction
Oncogene mutaties in de epidermale groeifactor receptor (EGFR) zijn te vinden in een subset van patiënten met niet-kleincellige longkanker (NKCLK) en zijn belangrijke voorspellende biomarkers voor deze ziekte1,2. Deze meestal het activeren van EGFR mutaties optreden als een in-frame verwijderen in exon 19 (delE746-A750) of een punt-mutatie leucine vervangen door arginine op codon 858 van exon 21 (L858R) in de EGFR tyrosine kinase domein3,4. Behandeling met EGFR-tyrosine kinase remmers (TKIs) is een klinisch effectieve therapie voor patiënten met NKCLK herbergen EGFR mutaties. Deze therapie wordt echter beperkt door de onvermijdelijke overname van weerstand tegen EGFR-TKIs zoals gefitinib en erlotinib. De meest voorkomende verworven resistentie treedt op door een secundaire T790M mutatie in exon 20 van EGFR, die werd ontdekt in ongeveer 60% van de patiënten die EGFR-TKI (gefitinib of erlotinib) weerstand verworven. Andere moleculaire mechanismen die zijn gekoppeld aan de verworven resistentie aan EGFR-TKIs zijn de activering van de rondweg signalering veroorzaakt door BMO amplificatie, transformatie van kleincellige longkankerziekten en epitheliale-naar-mesenchymale overgang5,6. De receptor voor de hepatocyte groeifactor, gecodeerd door het BMO-gen, die is dysregulatedin veel tumoren, is gemeld als een belangrijke kandidaat voor gerichte therapieën7,8.
Strategieën voor het overwinnen van de verworven weerstand tegen EGFR-TKIs ondergaan klinische evaluatie nu. Preklinische en klinische studies hebben aangetoond dat derde generatie EGFR-remmers zoals osimertinib effectief voor patiënten met de T790M mutatie9zijn. Daarnaast kan de groei van kanker van de EGFR-mutant met BMO amplificatie worden geremd door gecombineerde behandeling met EGFR – en BMO-TKIs6,10. Klinische beoordeling van een combinatie van BMO en EGFR-remmers bij patiënten met verworven weerstand tegen gefitinib en erlotinib zijn aan de gang nu11.
Om te studeren het moleculaire mechanisme van verworven weerstand tegen chemotherapeutische agenten, worden cellijnen die aanvankelijk op remmers reageren voortdurend behandeld met deze remmers. Er zijn twee methoden beschikbaar om verworven resistentie in cellijnen. Een stapsgewijze dosis-escalatie is, en anderzijds hoge concentratie blootstelling. De methode van de stapsgewijze escalatie is meer algemeen gebruikt, omdat er een hoger slagingspercentage. De cellen worden eerst blootgesteld aan lage concentraties van de remmers, bijna een tiende van de waarde van de helft-maximale remmende concentratie (IC50), en de concentratie wordt vervolgens geleidelijk verhoogd met 10-30% tot de concentratie van de doelgroep wordt bereikt. Hoge concentratie blootstelling bij deze methode wordt de cellen aan de laatste dosis van de Inhibitor van de omwenteling in het kweekmedium, dat meer dan de waarde van de IC50 , is dus de ouderlijke cellen zijn bijna volledig gedood bloot. Deze hoge-concentratie blootstelling methode heeft veel succes langzamer dan de methode van de stapsgewijze escalatie.
In een eerdere studie, gecombineerde behandeling met EGFR-TKI en BMO-TKI bleek effectief te zijn in een in vitro -systeem. Verworven weerstand tegen een EFGR-TKI, gefitinib, werd opgericht door stapsgewijze escalatie voor 12 maanden, samen met BMO-amplificatie, en dus een gefitinib-resistente cellijn PC-9MET1000 genaamd gegenereerde12was.
Het protocol hier gepresenteerd is een procedure in twee fasen dosis-escalatie voor het verkrijgen van EGFR-gemuteerd NKCLK PC-9 cellen met dubbele weerstand tegen de EGFR-TKI, gefitinib, en een BMO-TKI, PHA665752 (Figuur 1). Deze methode voor de vaststelling van verworven resistentie in cellijnen is relatief gemakkelijk uit te voeren, met een hoog slagingspercentage. Het protocol beschreven kan worden aangepast voor toepassing met remmers van andere moleculaire doel drugs en cytotoxische agenten ook.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol hier beschreven kan worden gebruikt voor de oprichting van verworven dual-resistentie in kankercellen met behulp van een methode 2-step dosis-escalatie in vitro. Vele onderzoeksdocumenten hebben gemeld dat PC-9 cellen EGFR-TKI (gefitinib of erlotinib) weerstand door T790M EGFR mutaties15,16ontwikkeld. We hebben echter niet T790M mutaties detecteren in exon 20 van onze cellen PC-9MET1000 door directe het rangschikken (fig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van het Instituut voor moleculaire oncologie voor hun doordachte opmerkingen en nuttig advies, en Editage voor hun hulp bij het bewerken van de Engelse taal. Dit werk werd gesteund door het MEXT-ondersteunde programma voor de strategische Research Foundation aan particuliere universiteiten (2012-2016) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan. Tohru Ohmori ontvangen onderzoek (2015-2016) financiering van Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Duitsland).
Materials
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
- Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
- Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
- Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from “never smokers” and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
- Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
- Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
- Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
- Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
- . NCT02468661 – ClinicalTrials.gov Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017)
- Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
- Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
- Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
- Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
- Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
- Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
- Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
- Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).
