Создание двойного сопротивления EGFR-тки и встретились тки в легких аденокарциномы клетки In Vitro дозы 2-шаг эскалации процедуры
Summary
Описан метод в пробирке для установления двойного сопротивления EGFR-тки и MET-тки в раковых клетках. Этот метод полезен для разработки методов лечения для пациентов с EGFR-мутации, которые показывают прогрессирование болезни, несмотря на лечение EGFR-тки с MET-усилители. Это также могут быть изменены для ориентации других молекул ингибиторов.
Abstract
Лекарственной устойчивости является серьезной проблемой в терапии рака. Поколение устойчивостью сублиний в vitro необходим для обнаружения новых механизмов для решения этой задачи. Здесь, доза 2-шаг эскалации метод для установления двойного сопротивление рецептор эпидермального фактора роста (EGFR)-тирозин киназы ингибитора (тки), гефитиниб и ВСТРЕТИЛ-тки, PHA665752, описан. Этот метод базируется на простые ступенчатой доза эскалации ингибиторов для стимулирования приобрела сопротивления в клеточных линиях. Альтернативный метод для создания устойчивых сублиний включает подвергая клетки высокой концентрации ингибитора в один шаг. Имеет более высокий метод поэтапного доза эскалации возможность успешно индуцировать приобрела сопротивление, чем этот метод. Активация EGFR мутации являются биомаркерами ответа на лечение с EGFR-тки, которая является прикладной первой линии для лечения немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), которые питают эти мутации. Однако несмотря на сообщения о эффективных ответных мер, использование EGFR-тки ограничено, потому что опухоли неизбежно приобрести сопротивление. Основные механизмы, лежащие EGFR-тки сопротивления включают вторичных мутации на сайте привратника, T790M в экзона 20 EGFR и обход сигнал MET. Таким образом потенциальное решение для этой проблемы будет сочетание EGFR-тки и MET-тки. Это комбинированное лечение было показано, чтобы быть эффективным в vitro исследования модели. Приобретенных гефитиниб сопротивление была учреждена через MET-усилители ступенчатой доза эскалации гефитиниб за 12 месяцев, и линия клетки, именем PC-9MET1000 был создан в предыдущем исследовании. Для дальнейшего изучения механизмов приобретенных MET-тки и EGFR-тки сопротивления, MET-тки, PHA665752, вводили в эти клетки с поэтапный доза эскалации присутствии гефитиниб на 12 месяцев. Этот протокол также успешно применяется для целого ряда комбинированной терапии установить приобретенное сопротивление других молекул ингибиторов.
Introduction
Онкогенных мутаций в рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) находятся в подмножество пациентов с не-немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) и являются важными интеллектуального биомаркеров этой болезни1,2. Эти наиболее часто активации EGFR мутации происходят как в рамки удаления в экзона 19 (delE746-A750) или Точечная мутация, заменив лейцина аргинина в кодон 858 экзона 21 (L858R) в EGFR тирозин киназы домена3,4. Лечение с EGFR-тирозин киназы ингибиторы (TKIs) является клинически эффективной терапии для больных НМРЛ, укрывательство EGFR мутации. Однако эта терапия ограничивается неизбежным приобретение сопротивления EGFR-TKIs например гефитиниб и эрлотиниб. Наиболее распространенных приобретенных сопротивления происходит через вторичные T790M мутация в экзона 20 EGFR, который был обнаружен в приблизительно 60% пациентов, которые приобрели EGFR-тки (gefitinib или эрлотиниб) сопротивление. Другие молекулярные механизмы, связанные с приобретенными сопротивление EGFR-TKIs являются активация обход сигнализации, вызванные ВСТРЕТИЛ амплификации, преобразование рака легких малых клеток и переходного эпителия в мезенхимальных5,6. Рецептор для фактора роста гепатоцитов, кодируемых ВСТРЕТИЛ Джин, который dysregulatedin многие опухоли, было сообщено быть важный кандидат для целевой терапии7,8.
Стратегии преодоления приобретенных сопротивление EGFR-TKIs настоящее время клинической оценки. Доклинические и клинические исследования показали, что ингибиторы EGFR третьего поколения, такие как osimertinib эффективны для пациентов с T790M мутации9. Кроме того рост рака EGFR-мутант с MET усиления может быть тормозится комбинированного лечения с EGFR и ВСТРЕТИЛ TKIs6,10. Клинические испытания, оценивающие сочетание встретились и EGFR ингибиторов в больных с приобретенной устойчивостью к гефитиниб и эрлотиниб сейчас ведутся11.
Изучать молекулярный механизм приобретенных сопротивление химиотерапевтических агентов, клеточных линий, которые первоначально реагировать ингибиторы рассматриваются непрерывно с этих ингибиторов. Установить приобретенное сопротивления в клеточных линий доступны два метода. Один является поэтапный доза эскалации, и других является воздействие высокой концентрации. Метод поэтапного эскалации более широко используются, потому что она имеет более высокий уровень успеха. Сначала клетки подвергаются воздействию низких концентрациях ингибиторов, почти десятая часть значения половины максимального ингибирующего концентрации (IC50), и концентрация затем постепенно увеличивается на 10-30%, пока не будет достигнута цель концентрации. Метод воздействия высокой концентрации включает подвергая клетки окончательный дозу ингибитора в среде культуры, который больше, чем значение50 , поэтому родительской клетки почти полностью погибают. Этот метод воздействия высокой концентрации имеет гораздо меньше успеха чем метод поэтапного эскалации.
В предыдущем исследовании чтобы быть эффективным в системе в vitro было показано комбинированного лечения с EGFR-тки и MET-тки. Приобретенных сопротивление EFGR-тки, гефитиниб, была учреждена путем поэтапного эскалации на 12 месяцев, наряду с MET-усилители, и таким образом, гефитиниб устойчивостью клеток линии, называется PC-9MET1000 созданного12.
Протокол, представленные здесь является доза эскалации двухэтапная процедура получения мутировал EGFR НМРЛ PC-9 клеток с двойной сопротивление EGFR-тки, гефитиниб и ВСТРЕТИЛ-тки, PHA665752 (рис. 1). Этот метод для создания приобрел устойчивы в клеточных линиях относительно легко выполнять с высокий уровень успеха. Описывается протокол могут быть изменены для приложений с ингибиторами других молекулярных целевой наркотиков и цитотоксических агентов также.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанные здесь может использоваться для создания приобретенных двойного сопротивления в раковых клетках, с помощью метода доза 2-шаг эскалации в пробирке. Многие исследования сообщили, что PC-9 клеток разработаны EGFR-тки (gefitinib или эрлотиниб) сопротивление через T790M EGFR мута…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов Института молекулярной онкологии за их продуманные замечания и полезные советы и Editage за их помощь с английским языком редактирования. Эта работа была поддерживаемые программой поддерживается МПКСНТ Фонд стратегических исследований в частных университетах (2012-2016 гг.) от министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии Японии. Тору совместно получили финансирование (2015-2016) исследований из Boehringer Ingelheim (Ингельхайм Германия).
Materials
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
- Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
- Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
- Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from “never smokers” and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
- Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
- Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
- Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
- Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
- . NCT02468661 – ClinicalTrials.gov Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017)
- Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
- Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
- Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
- Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
- Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
- Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
- Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
- Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).
