폐 선 암 세포에서 생체 외에서 2 단계 복용량 단계적 확대 절차와 EGFR TKI와 만난 TKI 듀얼 저항 설정
Summary
EGFR TKI와 암 세포에서 메트로 TKI 듀얼 저항을 설정 하기 위한 생체 외에서 방법을 설명 합니다. 이 방식은 메트로 증폭 EGFR TKI 치료에도 불구 하 고 질병의 진행을 전시 EGFR 돌연변이와 환자에 대 한 치료를 개발 하는 데 유용 합니다. 그것은 또한 다른 분자를 대상으로 하는 저 해제에 대 한 수정할 수 있습니다.
Abstract
약은 암 치료에 주요 도전 이다. 저항 sublines에 체 외에서 의 세대는 발견이 문제를 극복 하기 위해 새로운 메커니즘이 필요 합니다. 여기, 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)에 듀얼-저항을 설정 하기 위한 2 단계 복용량 단계적 확대 방법-티로신 키 니 아 제 억제제 (TKI), gefitinib, 그리고 메트로 TKI, PHA665752, 설명. 이 메서드는 간단한 기반 유도 대 한 억제제의 stepwise 복용량 확대 인수 셀 라인에 저항. 저항 sublines를 생성 하기 위한 대체 방법을 한 단계에서 억제 물의 높은 농도에 세포를 노출 포함 됩니다. Stepwise 복용량 에스컬레이션 메서드는 높은 성공적으로 유도의 가능성이이 방법 보다는 저항을 취득. EGFR 활성화 변이 EGFR TKI와 치료에 대 한 응답의 biomarkers 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC) 항구이 돌연변이 대 한 적용 된 첫 줄 치료. 그러나, 효과적인 응답의 보고서에도 불구 하 고 EGFR TKI 사용 제한 된다 종양 저항을 필연적으로 취득 하기 때문에. EGFR TKI 저항 뒤에 주요 메커니즘 게이트 키퍼 사이트, EGFR의 exon 20에에서 T790M 및 메트로의 우회 신호에 보조 돌연변이 포함합니다. 따라서,이 문제에 대 한 잠재적인 솔루션 EGFR TKI와 메트로 TKI의 조합 것입니다. 이 결합 된 치료 생체 외에서 연구 모델에서 효과적 이기 위하여 보였다. 인수 gefitinib 저항 메트로 증폭을 통해 gefitinib의 stepwise 복용량 확대 하 여 12 개월, 고 셀 라인 PC-9MET1000 라는 이전 연구에서 생성 된. 추가 획득된 메트로 TKI와 EGFR TKI 메커니즘을 조사 하기 위해 저항, 메트로 TKI PHA665752, 12 개월 gefitinib 존재 stepwise 복용량 단계적 확대와 이러한 셀에 관리 되었다. 이 프로토콜도 성공적으로 설정할 다른 억제 물 분자에 인수 저항 조합 요법의 수에 대 한 적용 되었습니다.
Introduction
표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR)에 종양 돌연변이 비 작은 세포 폐암 (NSCLC) 환자의 일부에서 발견 되며이 질병1,2의 중요 한 예측 생체. EGFR 돌연변이 가장 일반적으로 활성화 이러한 엑손 19에에서는 프레임 삭제 (delE746-A750) 또는 교체 신 exon 21 (L858R)의 codon 858에서 아르기닌 EGFR 티로신 키 니 아 제 도메인3,4점 돌연변이로 발생 합니다. EGFR 티로신 키 니 아 제 억제제 (TKIs)와 치료는 EGFR 돌연변이 품고 NSCLC 환자에 대 한 임상적으로 효과적인 치료. 그러나,이 치료는 gefitinib 등 erlotinib EGFR TKIs 저항의 피할 수 없는 인수에 의해 제한 됩니다. 가장 일반적인 획득된 저항 EGFR TKI gefitinib (erlotinib) 저항을 취득 하는 환자의 약 60%에서 검색 된 EGFR의 exon 20에서에서 보조 T790M 돌연변이 통해 발생 합니다. EGFR TKIs 인수 저항와 관련 된 다른 분자 메커니즘은 활성화 우회 신호 메트로 증폭, 작은 세포 폐 암 및 상피-엽 전환5,6의 변화에 의해 발생. 수용 체 메트로 유전자 인코딩 hepatocyte 성장 인자는 dysregulatedin 많은 종양, 중요 한 후보로 타겟 요법7,8될 것으로 보고 되었습니다.
EGFR TKIs를 인수 저항 극복을 위한 전략 이제 임상 평가 겪고 있다. 전 임상 및 임상 연구 osimertinib와 같은 3 세대 EGFR 억제제는 T790M 돌연변이9환자에 대 한 효과적으로 나타났습니다. 또한, 메트로 증폭 EGFR 돌연변이 암의 성장 EGFR 및 메트로 TKIs6,10결합된 치료에 의해 저해 수 있습니다. Gefitinib erlotinib를 인수 저항을 가진 환자에서 메트로 EGFR 억제제의 조합을 평가 하는 임상 시험11지금 진행 되 고 있다.
화학요법 에이전트에 저항을 취득된의 분자 메커니즘 연구, 셀 라인 처음 반응 억제제 하는 이러한 억제제와 지속적으로 처리 됩니다. 두 가지 방법 셀 라인에 인수 저항을 설정할 수 있습니다. Stepwise 복용량 단계적 확대, 하나 이며 다른 고 농도 노출 됩니다. Stepwise 에스컬레이션 메서드는 더 일반적으로 사용 되었다, 더 높은 성공률을가지고 있기 때문에. 세포는 처음 억제제, 거의 절반 최대한 억제 농도 (IC50) 값의 10 분의 낮은 농도에 노출 하 고 대상 농도 달성 될 때까지 농도 10-30%로 점차 증가 다음. 고 농도 노출 방법은 노출 셀 부모 세포는 거의 완전히 사망 이므로 IC50 값 보다 더 많은 문화 매체에 억제제의 마지막 복용량을 포함 한다. 이 고 농도 노출 메서드는 단계적 확대 방법 보다 훨씬 낮은 성공률.
이전 연구에서 EGFR TKI와 메트로 TKI 결합된 치료 체 외에 시스템에 효과적일 표시 했다. 인수는 EFGR TKI, gefitinib, 저항 메트로-증폭, 함께 12 개월에 대 한 단계적 확대를 통해 고 따라서, PC-9MET1000 라는 gefitinib 저항 셀 라인 생성된12이었다.
여기에 제시 된 프로토콜은 EGFR TKI, gefitinib, 그리고 메트로 TKI, PHA665752 듀얼 저항 NSCLC PC 9 EGFR 돌연변이 세포를 얻기 위해 2 단계 복용량 단계적 확대 절차 (그림 1). 이 방법은 인수 설정에 대 한 셀 라인에 저항은 비교적 쉽게 수행, 높은 성공률. 다른 분자 대상 약물 및 세포 독성 대리인 뿐만의 억제제와 응용 프로그램에 대 한 설명된 프로토콜을 수정할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜 인수 듀얼-저항 2 단계 복용량 에스컬레이션 메서드 시험관을 사용 하 여 암 세포에의 설립을 위해 사용할 수 있습니다. 많은 연구 논문 PC-9 셀 T790M EGFR 돌연변이15,16통해 EGFR TKI gefitinib (erlotinib) 저항 개발을 보고 있다. 그러나, 우리가 검색 하지 못했습니다 T790M 돌연변이 우리의 PC 9MET1000 셀의 exon 20에서에서 직접 연속 (<st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 사려깊은 의견 및 유용한 조언, 분자 종양학 연구소 그리고를 통해 그들의 영어 편집 Editage의 구성원 감사. 이 작품에서 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 일본의 사립 대학 (2012-2016 년) 전략 연구 재단에 대 한 문 부 과학성 지원 프로그램에 의해 지원 되었다. 도입한 가마타 Boehringer 인 겔 하 임 (인 겔 하 임, 독일)에서 연구 자금 (2015-2016 년)을 받았다.
Materials
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
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