2-adım doz-yükseltme yordamını akciğer adenokarsinom hücre Vitro EGFR-TKI ve bir araya geldi-TKI çift direnç kurulması
Summary
EGFR TKI ve MET-TKI kanser hücrelerinin içinde çift direnç kurmak için bir vitro yöntemi açıklanmıştır. MET-güçlendirme ile EGFR-TKI tedaviye rağmen hastalık ilerleme sergileyen EGFR mutasyon, hastalar için tedavi geliştirmek için yararlı bir yöntemdir. Ayrıca diğer molekülleri hedefleme inhibitörleri için değiştirilebilir.
Abstract
İlaç direnci kanser tedavisi büyük bir sorun olduğunu. Dayanıklı sublines vitro nesil bu zorluğu aşmak için roman mekanizmaları keşfetmek için gereklidir. Burada, çift-direnç bir epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) kurmak için 2-adım doz-yükseltme yöntem-tirozin kinaz inhibitörü (TKI), gefitinib ve MET-TKI, PHA665752, açıklanmıştır. Bu yöntem basit dayanır kademeli doz-artması inhibitörleri inducing için Edinsel direnç hücre hatlarında. Dayanıklı sublines oluşturmak için alternatif yöntem tek bir adımda inhibitörü yüksek konsantrasyonda hücrelere açığa içerir. Kademeli doz-yükseltme yöntemi daha yüksek bir sahiptir başarıyla inducing imkanı elde direnç bu yöntem daha. EGFR aktive mutasyonlar biyolojik tedavi ile EGFR-TKI, yanıt bir olan bu mutasyonlar liman küçük hücreli dışı akciğer kanserleri (NSCLC) için uygulanan bir ilk basamak tedavi olduğunu. Ancak, tümör, kaçınılmaz olarak direnç kazanmak çünkü rağmen raporları etkili tepkilerin EGFR-TKI kullanımı sınırlıdır. Ağ geçidi denetleyicisi site, exon 20 EGFR T790M ve MET bir yan yol sinyal ikincil bir mutasyon EGFR-TKI direnç arkasında büyük mekanizmaları içerir. Böylece, bu sorun için olası bir çözüm EGFR-TKI ve MET-TKI olacaktır. Bu kombine tedavi bir vitro çalışma modelinde etkili olduğu gösterilmiştir. Edinsel gefitinib-direnç MET-güçlendirme ile 12 ay için kademeli doz-artması tarafından gefitinib kurulmuş ve PC-9MET1000 adında bir hücre kültürünü bir önceki çalışmada oluşturuldu. Edinsel MET-TKI ve EGFR-TKI mekanizmaları daha ayrıntılı araştırmaya direnç, MET TKI, PHA665752, bu hücrelere gefitinib huzurunda kademeli doz yükseltme ile 12 ay için yönetiliyordu. Bu iletişim kuralı da başarıyla diğer inhibitörü moleküllere Edinsel direnç kurmak için kombinasyon tedaviler bir dizi için uygulandı.
Introduction
Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) oncogenic mutasyonlar küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) olan hastalarda alt kümesinde bulunur ve bu hastalığı1,2önemli akıllı biyolojik. Bunlar en sık EGFR mutasyon aktive exon 19 içinde bir çerçeve içinde silme (delE746-A750) ya da bir nokta mutasyon EGFR tirozin kinaz etki alanı3,4‘ te arginin kodon 858 exon 21 (L858R), lösin yerine olarak ortaya çıkar. EGFR tirozin kinaz inhibitörleri (TKIs) ile tedavi ile EGFR mutasyon yataklık NSCLC hastalar için klinik olarak etkili bir tedavi yöntemidir. Ancak, bu tedavi EGFR-TKIs direnç gefitinib ve erlotinib gibi kaçınılmaz edinimi ile sınırlıdır. En yaygın Edinsel direnç EGFR-TKI (gefitinib veya erlotinib) direnç alınan hastaların yaklaşık % 60 algılandı EGFR, exon 20 bir ikincil T790M mutasyon yoluyla ortaya çıkar. EGFR TKIs Edinsel direnç ile ilişkili diğer moleküler mekanizmaları tarafından MET amplifikasyon, küçük hücreli akciğer kanserleri ve epitel-için-Mezenkimal geçiş5,6neden yan yol sinyal aktif vardır. Reseptör için MET gen tarafından kodlanmış hepatosit büyüme faktörü olan dysregulatedin birçok tümör, önemli bir aday için hedeflenmiş tedaviler7,8olduğu bildirildi.
EGFR TKIs Edinsel direnç üstesinden gelmek için stratejiler şimdi klinik değerlendirme geçiyor. Preklinik ve klinik çalışmalar üçüncü nesil EGFR inhibitörü osimertinib gibi T790M mutasyon9olan hastalar için etkili olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, büyüme ile MET amplifikasyon EGFR-mutant kanserlerin kombine tedavi ile EGFR ve MET TKIs6,10tarafından inhibe olabilir. Klinik çalışmalarda gefitinib ve erlotinib Edinsel direnç ile MET ve EGFR inhibitörü hastalarda bir arada değerlendirilmesi devam şimdi11vardır.
Kemoterapötik ajanlar Edinsel direnç moleküler mekanizması çalışmaya, başlangıçta inhibitörleri için yanıt hücre hatları sürekli bu inhibitörleri ile tedavi edilir. Hücre hatlarında Edinsel direnç kurmak iki yöntem kullanılabilir. Bir kademeli doz-yükseltme ve diğer yüksek konsantrasyon pozlama. Daha yüksek bir başarı oranı olduğundan kademeli yükseltme yöntemi daha yaygın olarak kullanılmıştır. Hücreleri ilk inhibitörleri, yaklaşık 10 yarım-azami inhibitör konsantrasyon (IC50) değerinin düşük konsantrasyonlarda için sunulur ve hedef konsantrasyonu elde kadar konsantrasyonu sonra yavaş yavaş 10-30 oranında artar. Yüksek konsantrasyon pozlama yöntem inhibitörü de ebeveyn hücreler neredeyse tamamen öldürdüm ŞA50 değeri fazla olan kültür orta son doz hücrelere açıklamanızı içerir. Bu yüksek konsantrasyon pozlama yöntemi kademeli yükseltme yöntemi daha çok daha düşük bir başarı oranı var.
Bir önceki çalışmada, kombine tedavi ile EGFR-TKI ve MET-TKI vitro sistemde etkili olduğu gösterilmiştir. Bir EFGR-TKI, gefitinib, Edinsel direnç MET-güçlendirme, birlikte 12 ay için kademeli yükseltme yoluyla kurulmuş ve böylece, oluşturulan12PC-9MET1000 olarak adlandırılan gefitinib dayanıklı hücre çizgi oldu.
Burada sunulan Protokolü EGFR-TKI, gefitinib ve MET-TKI, PHA665752 çift kademeli dirençle EGFR mutasyona uğramış NSCLC PC-9 hücreleri elde etmek için bir iki adım doz-yükseltme işlemdir (şekil 1). Bu yöntem elde oluşturmak için hücre hatlarında dayanıklı, yüksek başarı oranı ile gerçekleştirmek nispeten kolaydır. Açıklanan protokol diğer moleküler hedef uyuşturucu ve sitotoksik ajanlar de inhibitörleri ile uygulama için değiştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan Protokolü 2-adım doz-yükseltme yöntemi içinde vitrokullanarak kanser hücreleri alınan çift direnç kurulması için kullanılabilir. Birçok araştırma kağıtları PC-9 hücreleri EGFR-TKI (gefitinib veya erlotinib) direnç T790M EGFR mutasyon15,16geliştirilen bildirdi. Ancak, biz T790M mutasyonlar bizim PC-9MET1000 hücreleri exon 20 doğrudan sıralama (şekil 4 c) tarafından tespit etmedi. A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz üyeleri onların düşünceli yorum ve faydalı tavsiyeler için moleküler Onkoloji Enstitüsü ve Editage İngilizce dil düzenleme ile onların yardım için teşekkür ederim. Bu eser için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonya üzerinden (2012-2016) özel üniversitelerde Stratejik Araştırma Vakfı MEXT desteklenen Program tarafından desteklenmiştir. Tohru Ohmori (2015-2016) finansman araştırma Boehringer Ingelheim (Ingelheim, Almanya) aldı.
Materials
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
- Lynch, T. J., et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med. 350 (21), 2129-2139 (2004).
- Paez, J. G., et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 304 (5676), 1497-1500 (2004).
- Pao, W., et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from “never smokers” and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13306-13311 (2004).
- Mitsudomi, T., et al. Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence. J Clin Oncol. 23 (11), 2513-2520 (2005).
- Sequist, L. V., et al. Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors. Sci Transl Med. 3 (75), 75ra26 (2011).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316 (5827), 1039-1043 (2007).
- Schmidt, L., et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 18 (14), 2343-2350 (1999).
- Olivero, M., et al. Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int J Cancer. 82 (5), 640-643 (1999).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372 (18), 1689-1699 (2015).
- Bean, J., et al. MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (52), 20932-20937 (2007).
- . NCT02468661 – ClinicalTrials.gov Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02468661 (2017)
- Yamaoka, T., et al. Acquired Resistance Mechanisms to Combination Met-TKI/EGFR-TKI Exposure in Met-Amplified EGFR-TKI-Resistant Lung Adenocarcinoma Harboring an Activating EGFR Mutation. Mol Cancer Ther. 15 (12), 3040-3054 (2016).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Cifone, M. A., Fidler, I. J. Correlation of patterns of anchorage-independent growth with in vivo behavior of cells from a murine fibrosarcoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (2), 1039-1043 (1980).
- Ercan, D., et al. Amplification of EGFR T790M causes resistance to an irreversible EGFR inhibitor. Oncogene. 29 (16), 2346-2356 (2010).
- Ogino, A., et al. Emergence of epidermal growth factor receptor T790M mutation during chronic exposure to gefitinib in a non small cell lung cancer cell line. Cancer Res. 67 (16), 7807-7814 (2007).
- Ando, K., et al. Enhancement of sensitivity to tumor necrosis factor alpha in non-small cell lung cancer cells with acquired resistance to gefitinib. Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8872-8879 (2005).
- Suda, K., et al. Reciprocal and complementary role of MET amplification and EGFR T790M mutation in acquired resistance to kinase inhibitors in lung cancer. Clin Cancer Res. 16 (22), 5489-5498 (2010).
- Shien, K., et al. Acquired resistance to EGFR inhibitors is associated with a manifestation of stem cell-like properties in cancer cells. Cancer Res. 73 (10), 3051-3061 (2013).
- Sagawa, Y., et al. Establishment of three cisplatin-resistant endometrial cancer cell lines using two methods of cisplatin exposure. Tumour Biol. 32 (2), 399-408 (2011).
- Ritter, C. A., et al. Human breast cancer cells selected for resistance to trastuzumab in vivo overexpress epidermal growth factor receptor and ErbB ligands and remain dependent on the ErbB receptor network. Clin Cancer Res. 13 (16), 4909-4919 (2007).
