Établissant double résistance à l’EGFR-TKI et rencontré-TKI dans le poumon adénocarcinome cellules In Vitro avec une procédure d’augmentation de la Dose 2-step
Summary
On décrit une méthode in vitro pour l’établissement de double résistance à l’EGFR-TKI et un MET-TKI dans les cellules cancéreuses. Cette méthode est utile pour développer des traitements pour les patients présentant des mutations-EGFR, qui montrent la progression de la maladie malgré un traitement EGFR-TKI avec MET-amplification. Il peut également être modifiée pour inhibiteurs ciblant d’autres molécules.
Abstract
La résistance aux médicaments est un défi majeur dans le traitement du cancer. La génération de sous-lignées résistant in vitro est nécessaire pour découvrir de nouveaux mécanismes pour relever ce défi. Ici, une méthode de doses 2 étapes progressives pour établir la double résistance à un récepteur de facteur de croissance épidermique (EGFR)-inhibiteur de tyrosine kinase (TKI), géfitinib et un MET-TKI, PHA665752, est décrite. Cette méthode est basée sur la simple augmentation de la dose progressive des inhibiteurs pour induire acquis une résistance dans des lignées cellulaires. L’autre méthode pour générer des résistantes sous-lignées consiste à exposer les cellules à de fortes concentrations de l’inhibiteur en une seule étape. La méthode d’augmentation progressive de la dose a une plus grande possibilité d’induire avec succès acquis une résistance à cette méthode. Activation d’EGFR mutations sont biomarqueurs d’une réponse au traitement par EGFR-TKI, qui est un traitement de première intention appliqué pour les cancers du poumon non à petites cellules (NSCLC) qui hébergent ces mutations. Cependant, malgré les rapports des réponses efficaces, l’utilisation de l’EGFR-TKI est limitée parce que les tumeurs inévitablement acquièrent la résistance. Les principaux mécanismes derrière la résistance de l’EGFR-TKI comprennent une mutation secondaire sur le site de portier, T790M dans l’exon 20 de l’EGFR et un signal de contournement d’Emu. Ainsi, une solution possible à ce problème serait une combinaison d’EGFR-TKI et MET-TKI. Ce traitement combiné a été montré pour être efficace dans un modèle d’étude in vitro . Géfitinib-résistance acquise a été créée par MET-amplification par augmentation de la dose progressive du géfitinib pendant 12 mois, et une lignée de cellules appelée PC-9MET1000 a été générée dans une étude antérieure. Afin d’étudier les mécanismes de MET-TKI acquis et EGFR-TKI résistance, un MET-TKI, PHA665752, a été administrée à ces cellules avec augmentation de la dose par étapes en présence de géfitinib pendant 12 mois. Ce protocole a également été appliqué avec succès pour un certain nombre de thérapies combinées pour établir une résistance acquise aux autres molécules.
Introduction
Oncogènes mutations dans le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) sont trouvent dans un sous-groupe de patients avec un cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) et sont des biomarqueurs prédictifs importants de cette maladie1,2. Ces activant les mutations EGFR plus souvent se produisent comme une délétion dans le cadre dans l’exon 19 (delE746-A750) ou une mutation ponctuelle remplacement leucine avec arginine au codon 858 de l’exon 21 (L858R) à l’EGFR tyrosine kinase domaine3,4. Traitement avec des inhibiteurs EGFR tyrosine kinase (inhibiteurs) est une thérapie efficace sur le plan clinique pour les patients atteints de CBNPC hébergeant des mutations EGFR. Toutefois, cette thérapie est limitée par l’inévitable acquisition de résistance aux inhibiteurs EGFR tels que le géfitinib et l’erlotinib. L’acquisition de la résistance la plus courante se fait par une mutation de T790M secondaire dans l’exon 20 de l’EGFR, ce qui a été détectée chez environ 60 % des patients ayant acquis une résistance (géfitinib ou erlotinib) de EGFR-TKI. Autres mécanismes moléculaires associés à une résistance acquise aux inhibiteurs EGFR sont activation de dérivation signalisation causée par une amplification MET, transformation des cancers du poumon à petites cellules et la transition épithéliale-mésenchymateuse5,6. Le récepteur pour le facteur de croissance des hépatocytes, codé par le gène MET, qui est dysregulatedin plusieurs tumeurs, a été rapporté pour être un candidat important pour ciblé les thérapies7,8.
Stratégies pour surmonter la résistance acquise aux inhibiteurs EGFR sont actuellement l’objet d’une évaluation clinique. Études précliniques et cliniques ont montré que les inhibiteurs d’EGFR de troisième génération tels qu’osimertinib sont efficaces pour les patients ayant la mutation de T790M9. En outre, la croissance des cancers EGFR-mutant avec amplification MET peut être inhibée par un traitement combiné avec INHIBITEURS EGFR – et MET6,10. Les essais cliniques évaluant une combinaison des inhibiteurs de la MET et l’EGFR chez les patients avec une résistance acquise aux géfitinib et l’erlotinib sont en cours maintenant11.
Pour étudier le mécanisme moléculaire de la résistance acquise aux agents chimiothérapeutiques, lignées cellulaires initialement aux inhibiteurs sont traitées en continu avec ces inhibiteurs. Deux méthodes sont disponibles pour établir une résistance acquise dans des lignées cellulaires. L’un est augmentation progressive de la dose, et l’autre est forte concentration exposition. La méthode d’escalade par étapes a été plus couramment utilisée, parce qu’il a un taux de réussite plus élevé. Les cellules sont d’abord exposées à de faibles concentrations des inhibiteurs, près d’un dixième de la valeur maximale de concentration inhibitrice (ci50), et la concentration est ensuite graduellement a augmenté de 10 à 30 % jusqu’à ce que la concentration de la cible est atteinte. La méthode forte concentration exposition consiste à exposer les cellules à la dernière dose d’inhibiteur dans le milieu de culture, qui est plus que la valeur50 , alors les cellules parentales sont presque complètement tués. Cette méthode d’exposition forte concentration a beaucoup un plus faible taux de réussite que la méthode d’escalade par étapes.
Dans une étude antérieure, c’est un traitement combiné avec EGFR-TKI et MET-TKI qui s’est avéré efficace dans un système in vitro . La résistance acquise à un EFGR-TKI, gefitinib, a été créée par une escalade progressive pendant 12 mois, ainsi que de MET-amplification, et par conséquent, une lignée de cellules géfitinib résistant appelée PC-9MET1000 a été généré12.
Le protocole présenté ici est une procédure de doses progressives en deux étapes pour l’obtention de muté EGFR NSCLC PC-9 cellules avec une double résistance à l’EGFR-TKI géfitinib et un MET-TKI, PHA665752 (Figure 1). Cette méthode d’établissement acquis résistant dans les lignées cellulaires est relativement facile à réaliser, avec un taux de réussite élevé. Le protocole décrit peut être modifié pour usage avec les inhibiteurs d’autres médicaments de la cible moléculaire et aussi bien des agents cytotoxiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici peut être utilisé pour la mise en place de double-résistance acquise dans les cellules cancéreuses à l’aide d’une augmentation de la dose 2-step méthode in vitro. De nombreux travaux de recherche ont rapporté que PC-9 cellules développé EGFR-TKI (géfitinib ou erlotinib) résistance à T790M EGFR mutations15,16. Cependant, on n’a pas détecté les mutations T790M dans l’exon 20 de nos cellules de PC-9MET1000 par …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres de l’Institut d’oncologie moléculaire pour leurs commentaires judicieux et de bons conseils et Editage pour leur aide avec l’édition de langue anglaise. Ce travail a été soutenu par le programme MEXT-prise en charge pour la Fondation de recherche stratégique dans les universités privées (2012-2016) depuis le ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et technologie du Japon. Tohru Ohmori a reçu (2015-2016) de financement de la recherche de Boehringer-Ingelheim (Ingelheim, Allemagne).
Materials
| RPMI-1640 | Wako | 189-02025 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| CellTiter 96 | Promega | G4100 | Non-Radioactive Cell Proliferation Assay |
| FBS | gibco | 26140-079 | |
| Pen Strep | gibco | 15140-163 | |
| gefitinib | Selleck | S1025 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| PHA665752 | Selleck | S1070 | stocked 10 mM/EMSO at -20ºC |
| 96-well plate | IWAKI | 860-096 | flat bottom with lid, low evaporation type |
| TC10 Automated Cell Counter | BIO RAD | #1450010 | |
| CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay | Promega | G4100 | Dye Solution and Solubilization/Stop Solution |
| Powerscan HT microplate reader | BioTek | ||
| GraphPad Prism v.5.0 software | GraphPad Inc. | ||
| PC-9 | Riken BioResource Center | RCB4455 | |
| P100 dish | FALCON | 353003 |
References
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