Summary
الهدف العام من هذا البروتوكول هو للتدليل على كيفية تقديم الروائح من تقلبات منخفضة لتسجيل واحد سينسيلوم من ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية مستقبلات الشمية التي تستجيب لفيرومونات القشرية طويلة السلسلة.
Abstract
تعتمد الحشرات على إحساسها بالرائحة لتوجيه مجموعة واسعة من السلوكيات الحاسمة لبقائها، مثل البحث عن الطعام، وتجنب المفترس، وضع البيض، والتزاوج. وقد تم تحديد المواد الكيميائية التي لا تعد ولا تحصى من تقلبات متفاوتة كما الروائح الطبيعية التي تنشط الحشرات الخلايا العصبية مستقبلات أولفاكتوري (أورنز). ومع ذلك، فقد عرقلت دراسة ردود حاسة الشم إلى رائحة منخفضة التقلبات بسبب عدم القدرة على تقديم مثل هذه المحفزات بشكل فعال باستخدام أساليب توصيل الرائحة التقليدية. هنا، ونحن تصف الإجراء الذي يسمح العرض الفعال للالرائحة منخفضة التقلبات لفي الجسم الحي تسجيل سينسيلوم واحد (سر). من خلال تقليل المسافة بين مصدر الرائحة والأنسجة المستهدفة، يسمح هذا الأسلوب لتطبيق الرائحة بيولوجيا ولكن حتى الآن الروائح التي لا يمكن الوصول إليها، بما في ذلك حمض بالميتوليك، فرمون تحفيز مع تأثير واضح على أورنس المشاركة في السلوك التزاوج والتزاوج 1 .وبالتالي لدينا الإجراء يتيح وسيلة جديدة لفحص مجموعة من الروائح منخفضة التقلبات لدراسة الشم الحشرات والاتصالات فرمون.
Introduction
ذبابة الفاكهة تستجيب أورنس لعدد كبير من الروائح الكريهة، مع أطوال سلسلة الكربون واسعة النطاق ومجموعة متنوعة من المجموعات الوظيفية، بما في ذلك الاسترات والكحول والكيتونات والكتونات والألدهيدات والتيربين والأحماض العضوية والأمينات ومركبات الكبريت والحلقات غير المتجانسة والعطريات 2 ، 3 - تختلف الروائح في خصائصها الفيزيائية يمكن أن يكون لها تقلبات مختلفة بشكل ملحوظ، ويشار إليها بضغط بخار المركب. والجدير بالذكر أن الروائح ذات الصلة بيولوجيا لذبابة الفاكهة ميلانوغاستر تختلف بشكل كبير في تقلباتها. على سبيل المثال، IR92a أورنس تستجيب للأمونيا 4 ، وهو متقلب للغاية، مع ضغط بخار 6،432 مم زئبق عند 20 درجة مئوية. في المقابل، OR67d أورنس الرد على فرمون الذكور، رابطة الدول المستقلة خلات -vaccenyl ( ج فا) 5 ، 6 ، ضغط البخار الذي هو 43 مم زئبق في 20 درجة مئوية.
ove_content "> إن دراسة الاستجابة الشمية لرائحة التقلب المنخفض تحديا بشكل خاص مع الطرق التقليدية لتسليم الروائح، حيث يتم تسليم الروائح عبر تيار هوائي ناقل على مسافة طويلة نسبيا ( أي عدة سنتيمترات)، وعلى هذا النحو، إلى رائحة منخفضة تقلب منخفض يمكن أن تختلف إلى حد كبير، اعتمادا على تصميم نظام تسليم الرائحة.على سبيل المثال، ورد رد فعل أورن OR67D إلى جرعة عالية من ج فا تتراوح بين ~ 40 7 -> 200 المسامير / ق 6 وعلاوة على ذلك، من المرجح عزا تسليم غير الفعال للج VA مع طرق التسليم التقليدية إلى النتائج السلبية الكاذبة، مما يؤدي إلى التفسير الذي ج VA في حد ذاته لا يكفي لتنشيط Or67d ORNs 8. وطعن هذا التفسير بعد دراسة أخرى باستخدام على مقربة من طريقة الروائح التسليم 9. ولذلك فمن إمبيرامن أجل تطوير نظام قوي لتسليم الروائح من أجل العرض الفعال للرائحة ذات التقلبات المنخفضة.في الآونة الأخيرة، حددنا العديد من سلسلة طويلة الأحماض الدهنية الدهنية كما بروابط ل أورنس أور 47b. وهي موجودة في نوع 4 أنتينال تريشويد سينسيلوم (at4). من بين سلسلة طويلة من الروائح الكريهة الأحماض الدهنية، وجدنا أن حمض بالميتوليك يعمل كفرمون مثير للشهوة الجنسية الذي يعزز محاكم الذكور عن طريق تفعيل أورنس أور 47b 1 . ومع ذلك، في دراسة أخرى باستخدام طريقة تقليدية رائحة التسليم، وأظهرت لوريت الميثيل لانتزاع ردود من أورنس أور 47b، في حين أن حمض بالميتوليك أثار أي رد عندما قدمت من نفس المسافة 10 . بالمقارنة مع C فا، الأحماض الدهنية طويلة السلسلة هي أقل تقلبا، مع ضغوط بخار أقل من 0.001 مم زئبق عند 25 درجة مئوية 11 . التذبذب المنخفض بطبيعته من الروائح الكريهة الأحماض الدهنية الطويلة السلسلة، والذي يحول دون العرض الفعال للهوائي عبرأنظمة تسليم الرائحة التقليدية، من المرجح أن تمثل نتائج سلبية كاذبة 10 . هذا التناقض يسلط الضوء على عدم كفاية أنظمة تسليم الرائحة التقليدية في تقديم الروائح منخفضة التقلب. وقد تبين سابقا أن التسليم الفعال للروائح الغليان يطير يتطلب قريبة من مصدر الرائحة والأنسجة المستهدفة 6 . وهكذا، لتوصيف كامل آثار الفيرومونات النشطة بيولوجيا في حين محاكاة المسافة التي من المحتمل أن تواجهها ذباب الفاكهة في الطبيعة 12 ، 13 ، اتفقنا على أن الحد الأدنى من المسافة يجب أن تمنح أولوية عالية في إجراءاتنا.
أسلوبنا يحمل المزيد من المزايا، بما في ذلك التوافق مع منصات الكهربية القياسية والتقنيات. تتطلب أجهزة تلاعب الحفار الموجودة مسبقا الحد الأدنى من التعديل لاستيعاب هذا البروتوكول، ومعظم خطوات سر تتطلب تعديلات طفيفة فقط. هذهيجعل تقنيتنا متاحة بسهولة للباحثين من ذوي الخبرة في سر. وعلاوة على ذلك، وتقنياتنا يسمح لعرض الروائح ذات تقلبات منخفضة مع بداية حادة والإزاحة، وربط تسليم التحفيز مع استجابة الخلايا العصبية. وأخيرا، يسهل تخطيط الأجهزة التبادلات السريعة بين خراطيش الرائحة، وتسريع جمع البيانات على مدى الجرعة المطلوبة.
نبدأ من خلال مراجعة إعداد مرجعية وتسجيل أقطاب، الكبار مثل المحلول الدملمف (أهل)، خراطيش تسليم الرائحة، و أولفاكتوميتر المقابلة. ثم نناقش إعداد حلول بالميتوليك حمض رائحة، تليها إعداد ذبابة للتسجيل. ونحن نمضي قدما في النظر في معايير اختيار سنسيلوم الخلقي لتسجيل وأكثر عن كثب تحديد المواقع من خرطوشة رائحة قبل تقديم البيانات التمثيلية المكتسبة باستخدام هذه الطريقة. وأخيرا، نختتم من خلال استكشاف التطبيقات المفيدة لهذا تكنيقإي، بعض القضايا التي واجهتها، وحلولها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الأجهزة ل at4 تسجيل
- استخدام أداة ماصة مجتذب لإعداد أقطاب مع الشعيرات الدموية الزجاج ألومينوسيليكات (أود 1.0 ملم، إد 0.64 ملم). حادة غيض من القطب إشارة قليلا مع زوج من ملقط غرامة لتسهيل الإدراج في كليبيوس من الطاير ( أي لوحة مدورة في الجزء الأمامي من رئيس ذبابة، فوق الفم).
ملاحظة: تم استخدام الذكور وت البالغ من العمر 7 أيام (برلين) في هذه الدراسة. استخدام أهل محلول ملحي 14 كما بالكهرباء لكلا الأقطاب. - إعداد 1 L من AHL عن طريق خلط 900 مل من الماء المقطر مع 6.312 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.373 غرام من بوكل، 0.337 غرام من NaHCO 3، 0.1120 غرام من ناه 2 PO 4، 1.892 غرام من طرهالوز ּ 2 H 2 O، 3.423 غرام من السكروز، 1.192 غرام من هيبيس، و 8.2 مل من 1M مغكل 2 . باستخدام الماء المقطر، وجلب الحجم الإجمالي يصل إلى 1 L. جلب الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 1 N هيدروكسيد الصوديوم وتعقيم الحل معفراغ-- يحركها نظام تصفية. للتخزين على المدى الطويل، والحفاظ على أليكوتس أهل في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: تسليم متسقة من حمض بالميتوليك تتوقف على التوحيد بين خراطيش. فمن الأهمية بمكان أن يتم تجميع كل خرطوشة بطريقة استنساخه. - باستخدام شفرة حلاقة، إزالة 0.9 سم من غيض من 200 ميكرولتر ماصة طرف لإنشاء أول خرطوشة القسم، قياس 4.1 سم؛ الرجوع إلى أبعاد مفصلة في الشكل 1A . استخدام آخر 200 ميكرولتر ماصة طرف وإزالة 1.7 سم و 1.5 سم من طرف والقاعدة، على التوالي، لإنشاء قسم خرطوشة الثاني، وقياس 1.8 سم ( الشكل 1A ). استخدام مسطرة لضمان استنساخه.
- استخدام ⅛ "ثقب الناخس لقطع أقراص من ورقة الترشيح.
- استخدم ملقط لوضع قرص ورق الترشيح في طرف قسم الخرطوشة الثاني. تأكيد بصريا أن هناك فتحة في طرف خرطوشة التي يمكن أن تمر الهواء.
- إرفاق مقاطع خرطوشة الأولى والثانية معا، كما هو مبين في الشكل 1A . زاوية قسم خرطوشة الثاني النزولي لتسهيل ساحة تهدف إلى الإعدادية ( الشكل 1B ).
- توصيل خرطوشة مع أنبوب تسليم الرائحة، التي شنت على ميكرومانيبولاتور.
ملاحظة: هذا التصميم يسمح خرطوشة لتكون سويفلد الخارج لتسهيل تبادل ( الشكل 1C ). - تعيين تدفق الهواء ترطيب مستمر إلى 2 لتر / دقيقة في وحدة تحكم كتلة واحدة وتدفق الرائحة إلى 500 مل / دقيقة في وحدة تحكم كتلة أخرى.
- باستخدام البرنامج (انظر جدول المواد )، برنامج الإجراء لإدارة نفخة رائحة مس 500.
2. إعداد بالميتوليك حمض أودورانت حلول للتسليم
ملاحظة: Or47b ORNs الرد على كل من رابطة الدول المستقلة - وحمض -palmitoleic غير المشبعة. كما حمض بالميتوليك غير مستقر في RT، يتم تخزين الأسهم في -20 درجة مئوية وتستخدم في غضون شهر عند الافتتاح. الإيثانول هو المذيب المفضل للحمض بالميتوليك.
- استخدام خلاط دوامة لخلط بدقة 10 ميكرولتر من المخزونات cis- أو ترانس- بالميتوليك حمض أو التخفيفات مع 90 ميكرولتر من الايثانول بنسبة 100٪ لمدة 10 أضعاف التخفيفات المسلسل في 1.7 مل ميكروتوبس. إعداد التخفيفات حمض بالميتوليك جديدة يوميا قبل التجارب واستخدامها في غضون يوم واحد.
ملاحظة: ل أودورانتس التي ليست قابلة للذوبان في الإيثانول، ويوصى قنينة زجاجية لإعداد التخفيفات رائحة مع أنواع أخرى من المذيبات العضوية. - باستخدام ميكروبيبيت P10، وتطبيق 5 ميكرولتر من رابطة الدول المستقلة حلول حمض -palmitoleic من التخفيفات المطلوب لورق الترشيح في كل خرطوشة المقابلة.
ملاحظة: أعلى جرعة (10 -1 ) يحتوي على 450 ميكروغرام من المركب. بالنسبة للحلول حمض عبر -ibmitoleic، وتطبيق 4.5 ميكرولتر بدلا من ذلك بحيث يحتوي على أعلى جرعة (10 -1 ) أيضا 450 ميكروغرام من رانه مجمع. - لتتبخر تماما المذيبات، ووضع خراطيش حمض بالميتوليك في مجفف المجفف لمدة 1 ساعة في رت و 7.59 ملم زئبقي من الضغط.
ملاحظة: خراطيش يمكن استخدامها لمدة تصل إلى 4 ساعات في رت.
3. إعداد ذبابة الفاكهة للوصول جاهز ل at4 سنسيلا لفي فيفو التسجيلات الكهربية
ملاحظة: يتم تربة الذباب وت (برلين) في وسط الذرة المتوسطة في 25 درجة مئوية في دورة 1212 ضوء الظلام. عند الانفصال، يتم فصل الذباب حسب الجنس إلى مجموعات من عشرة، حيث يتم تجميعها حتى 7 د من العمر. OR47b أورنس في الذباب الذكور والإناث على حد سواء تستجيب لحمض بالميتوليك. وللتبسيط، يتم فحص الذباب الذكري فقط في الدراسة الحالية.
- تجميع شريحة الطيران الإعدادية: على شريحة زجاجية، ووضع ساترة الزجاج (18 × 18 ملم 2 ) على كمية صغيرة من الطين النمذجة، وتشكيل ~ 3 درجة زاوية مع شريحة زجاجية. وضع الشريط على الوجهين على البريد الداخليدج من ساترة وعلى منطقة الشريحة أدناه مباشرة. استبدال مع شريط جديد لكل يوم من تسجيل ( الشكل 2A ).
- استخدام الشافطة يطير 15 لجمع ذبابة من الفائدة في الأنابيب ومن ثم تناسب 200 ماصة ميكرولتر طرف على نهاية الأنبوب. في وقت واحد نفض الغبار أنبوب إلى الأمام في حين تهب الهواء في أنبوب لدفع الطاير إلى نهاية طرف ماصة. استخدام شفرة حلاقة لقطع فقط تحت الجسم من الطاير و 2 رؤساء أطوال فوق الطاير.
- تامب الجزء السفلي من طرف ماصة مع الطين النمذجة، ودفع يطير إلى أعلى حتى يتعرض كل من هوائيات و كوليوس ( الشكل 2B ). لتجنب قتل الذبابة، إضافة فقط ما يكفي من الطين لفضح هوائيات و أريستاي، وهذا يمنع البطن من يطير من سحق. وعلاوة على ذلك، إضافة الطين ببطء وبلطف لمنع أي انقباض مفاجئ. تأكد من أن الطاير على قيد الحياة عن طريق التحقق من أنتينالأو حركة بروبوسيس.
- استخدام ملقط للمناورة طرف ماصة الذي يطير. توجيه الرأس بحيث تواجه كليبينوس إلى يمين المراقب. ضبط الإعدادية على طول ساترة باستخدام ملقط غرامة حتى الجانب الجانبي للهوائي يكمن على سطح ساترة مسجلة ( الشكل 2B ).
- وضع قضيب عقد على أريستا لتأمين الهوائي إلى الشريط على الوجهين لمنع الحركة ( الشكل 2B ).
ملاحظة: يتم سحب قضيب عقد من الزجاج البورسليكات الشعرية مع مجتذب ماصة وعقد في موقف مع الطين النمذجة ( الشكل 2A ). - وضع الإعدادية على مرحلة تلاعب ( الشكل 2C ). باستخدام المجهر، تأكد من أن تريتشويدس مرئية على طول الحافة البعيدة الوحشية للجزء الثالث من الهوائي.
ملاحظة: من الناحية المثالية، يجب أن تكون ظلية سنسيلا بوضوح ضد الخلفية، مما يبسط لهم وتحديد وتسهيل تسجيل ( الشكل 3 ). في هذا التحضير، فإن غالبية سنسيلا خندقية يمكن الوصول إليها هي من نوع at4. - إبقاء الإعدادية تحت تدفق الهواء ترطيب مستمر (2 لتر / دقيقة) تسليمها عن طريق أنبوب منفصل تسليم الهواء من مسافة حوالي 2 سم من الإعدادية ( الشكل 4 )، كما هو موضح سابقا 2 ، 15 .
4. تسجيل في النشاط 4 سينسيلوم من أورنس أور 47b في AT4 تريشوادس في الاستجابة لحمض بالميتوليك
- إدراج القطب المرجعي في كوليوس ( الشكل 3A ). لتجنب تلف الأنسجة، تأكد من أن يتم إدراج القطب أسفل السطح مباشرة، حيث يمكن الاتصال الدملمف تحت بشرة، مع حركة سريعة وسلسة.
- خفض القطب تسجيل ببطء ببطء يدخل نفس الطائرة من وجهة نظر كما سينسيلوم الهدف (= "زفيغ"> الشكل 3B). سجل تحت عدسة الهدف 50X.
ملاحظة: إهاب تريتشويدال صعبة يتطلب إدخال القطب تسجيل في قاعدة سينزيلار، الذي يوفر مساحة أوسع هدف أكبر أن يقلل من احتمال أن انحرف الكهربائي بعيدا ( الشكل 3B ، أقحم). - قبل تطبيق المحفزات رائحة إلى سينسيلوم، ومراقبة معايير الاختيار التالية. ينبغي رفض أي خندقية فشل في تلبية هذه المعايير واختيار سنسيلوم بدلا من ذلك.
- لاحظ نسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء (انظر الشكل 3C على سبيل المثال).
- مراقبة طفرات محددة من at4A و at4C الخلايا العصبية ( الشكل 3C ).
ملاحظة: من ملاحظة، يظهر ارتفاع AT4B ارتفاع مشابهة جدا ل at4A 10 ولا يمكن التعرف عليها بسهولة دون تحفيز رائحة. - لاحظ أن معدل إطلاق القاعدية من الخلايا العصبية AT4A هوحول أو تحت 20 هرتز.
ملاحظة: هذا المعيار هو محدد ل at4A لأن معدل اطلاق القاعدية للخلايا العصبية هو أعلى من ذلك من أورنس الأساسية 2 . ويشير إطلاق القاعدية أعلى بكثير إلى أن الخلايا العصبية قد تكون قد تضررت أثناء الإدراج الكهربائي.
- توصيل خرطوشة إلى أنبوب تسليم الرائحة. تبدأ مع السيطرة المذيبات ومن ثم أودورانتس، من انخفاض إلى تركيزات عالية. استخدام ميكرومانيبولاتور للمناورة خرطوشة نحو الإعدادية بينما تهدف خرطوشة مباشرة على رأس الإعدادية. تأكيد بصريا أن خرطوشة وأشار مباشرة في الهوائي ( الشكل 4 ) من بضعة مليمترات بعيدا.
ملاحظة: الهدف هو توجيه افتتاح خرطوشة مباشرة في الهوائي ووضعه على مقربة من الأنسجة المستهدفة. - تأكد من أن خرطوشة الرائحة مفصولة عن قطب التسجيل على يمينها من 1 - مم 2 ومن الطاير قبلp أسفل ما يقرب من 1 ملم.
ملاحظة: في الإعداد الموصوفة هنا، يحدها خرطوشة رائحة بشكل وثيق من القطب الكهربائي، القطب المرجعي، والشريحة الإعدادية الطيران ( الشكل 4 ).
ملاحظة: الالتفات إلى المسافة بين خرطوشة وتسجيل / أقطاب المرجعية. ويوصى مسافة حوالي 4 ملم 1 . اتصال غير مقصود قد إنهاء إشارة وكسر غيض من القطب تسجيل، وإلحاق الضرر الخلايا العصبية الحالية وتعقيد مزيد من التسجيلات.
ملاحظة: النظر في المسافة الفاصلة بين خرطوشة والشريحة الإعدادية الطيران. لمس ساترة قد طرد أيضا تسجيل القطب لتعطيل التسجيل. - اضغط على "سجل" في برنامج الحصول على البيانات لبدء التسجيل.
ملاحظة: بالنسبة لكل تسجيل 10 ثوان، يتم تسليم نبضة رائحة بمسافة مس 500 مباشرة إلى الهوائي، كما هو موضح في الخطوة 1.9. - بعد تطبيق الرائحة،سحب بعناية خرطوشة قبل استبدالها مع خرطوشة من أعلى تركيز المقبل. استمر حتى يتم الحصول على مجموعة الجرعة بأكملها.
ملاحظة: من المستحسن أن يتم تسجيل أورن واحد فقط أور 47b من كل ذبابة لتجنب أي آثار محتملة للتكيف. - شطف تماما تسجيل القطب مع الماء المقطر بعد الانتهاء من تسجيل لهذا اليوم.
- تحليل ورسم البيانات باستخدام برامج تحليل متواجد حاليا المتاحة تجاريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تطبيق أسلوبنا بنجاح لتحديد فعالية نسبية من عبر ( الشكل 5A ) مقابل رابطة الدول المستقلة ( الشكل 5B ) ايزومرات حمض بالميتوليك. وتظهر بيانات ممثل لدينا أن عبر حمض -Bmitoleic هو يجند أكثر فعالية ل أورنس أور 47b بالمقارنة مع إسوفورم رابطة الدول المستقلة ( الشكل 5C ). وسجلت خلية عصبية واحدة من كل ذبابة، مع اثني عشر الذباب سجلت في منحنى الجرعة، ليصبح المجموع 24 الذباب. تم الحصول على البيانات الجماعية من ثلاثة تكرار مستقل من التجارب، مع 8 الذباب سجلت في كل منهما. تمثل أشرطة الخطأ سيم
وتجدر الإشارة إلى أن المسافة بين فتح خرطوشة الرائحة ورأس الطاير لها تأثير كبير على نتيجة التسجيل. للحصول على استجابة كبيرة ل pحمض الأميتوليك في أورنس أورس 47، قدمنا رائحة على مسافة قريبة، حوالي 4 ملم بعيدا عن الهوائي 1 ( الشكل 6A ). عندما يتم عرض حمض بالميتوليك بعيدا عن الهوائي (~ 11 ملم)، ونحن يمكن أن نادرا ما نلاحظ أي استجابة كبيرة من أورنس أوراس 47a نفسه ( الشكل 6B ). هذه النتائج تسلط الضوء على أهمية العرض عن قرب من حمض بالميتوليك ( الشكل 6C -D ). تم جمع البيانات من تجارب موازية من 6 الذباب الذكور (برلين، 7 د القديمة). تم تسجيل أورن واحد أور 47b / يطير. تمثل أشرطة الخطأ سيم
الشكل 1: خرطوشة وإعداد أولفاكتوميتر. ( A ) إعداد خراطيش رائحة. من اليسار إلى اليمين: معيار 200 ميكرولترماصة طرف، الأولى و الثانية أقسام خرطوشة، و خرطوشة رائحة الانتهاء. ( B ) خرطوشة متصلة أولفاكتوميتر، والتي تبين الصعود نزولا من القسم الثاني. ( C ) الإعداد أولفاكتوميتر تصور أنبوب تسليم الرائحة التي شنت على ميكرومانيبولاتور، مع خرطوشة رائحة المرفقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد ذبابة الفاكهة . ( A ) إعداد كامل، والتي تبين المواقف النسبية للطاير، ساترة، وعقد قضيب. ( ب ) نظرة عن قرب من الإعدادية، والتي تبين المواقع من الذبابة، اتجاهه أنتينال، و كليبيوس لها. يتم وضع قضيب عقد فوق أريستا،وتأمين الجزء الثالث من الهوائي إلى الشريط ذي الوجهين. ( C ) إعداد تزوير. جميع العناصر الرئيسية مشروحة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحديد 4 سينسيلوم ل سر. ( A ) عرض 4X من الإعدادية، والتي تبين القطب المرجعي إدراجها في كوليبيوس، وعقد قضيب فوق أريستا، والقطب تسجيل وضعه بالقرب من الجزء أنتينال الثالث. ( B ) عرض 50X من القطب، تستعد لإدراج في 4 تريتشويد. أقحم: رسم توضيحي لموقف قطب التسجيل. ( C ) آثار ممثل سر من النشاط ارتفاع خط الأساس، مما يدل على جيدة (أعلى) أو الفقراء (القاع) إشارة إلى نويس ه. نسبة إشارة جيدة إلى الضوضاء يسمح تحديد موثوق بها من at4A و at4c المسامير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: موضع الخرطوشة. ( A ) ويهدف خرطوشة رائحة مباشرة على رأس الطاير من مسافة بضعة ملم. ( B ) وجهة نظر أخرى من الإعدادية و أولفاكتوميتر من زاوية مختلفة. ( C ) نظرة مقربة من الإعدادية و أولفاكتوميتر، والتي تبين موقف خرطوشة رائحة فوق الشريحة ذبابة الإعدادية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
جنرال الكتريك = "1"> 
الشكل 5: يتتبع ممثل والجرعات المنحنيات من أورنس أور 47b ردا على رابطة الدول المستقلة - أو عبر حمض البيتوليك. ( أب ) سر من AT4A أورنس التي تعبر عن مستقبلات OR47b مع ترانس - ( A ) أو رابطة الدول المستقلة حمض -palmitoleic ( B ). وقد أجريت تسجيلات مع الذكور وت البالغ من العمر 7 سنوات الذكور. ويظهر الرسم البياني ارتفاع ارتفاع (وسط) ورسم بياني التحفيز الوقت (أسفل، مثبتة في 50 مللي ثانية) أدناه آثار العينة (ن = 12). ( C ) منحنيات الجرعة والاستجابة مقارنة الاستجابات ارتفاع أورن ب أور 4747 إلى رابطة الدول المستقلة - أو عبر حمض البيتوليك. متوسط ± سيم (* p <0.05؛ ** p <0.01؛ t -test). السيطرة: السيطرة السلبية دون حمض بالميتوليك. الرجاء الضغط هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تفعيل at4A بواسطة حمض بالميتوليك يتطلب التحفيز على المدى القريب. ( أب ) سر من AT4A أورنس في ويلديب 7 أيام من العمر الذكور برلين. تم تسليم رابطة الدول المستقلة حمض -palmitoleic على مسافة قريبة (~ 4 ملم) أو أبعد من ذلك (~ 11 مم) (ن = 6). ( C ) مقارنة الاستجابات ارتفاع المقابلة (مثبتة في 50 مللي ثانية، ممهدة بيري التحفيز الوقت الرسوم البيانية). ( D ) مقارنة استجابات ارتفاع متوسط المقابلة. ردود AT4A إلى انخفاض حمض بالميتوليك بشكل ملحوظ كما يزيد المسافة التحفيز. أعيد طباعته بإذن من الشكل S4 في المرجع 1 . الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، وصفنا الإجراء الذي الردود من أورنس أور 47b إلى حمض بالميتوليك يمكن أن يسببها بقوة وتسجيلها. قمنا بتعديل التقليدية لمسافات طويلة طريقة تسليم رائحة 2 ، 7 ، 10 لاستكشاف مشكلة عدم كفاية فيرمون تسليم رائحة. تناولنا مسألة التقلبات المنخفضة الرائحة من خلال تسليم المجمع عبر خراطيش الرائحة، التي يتم فتحها داخل ملليمتر من الإعدادية. عندما يتم النظر في بناء متسقة ووضع كل خرطوشة رائحة، هذا البروتوكول يتجلى كطريقة فعالة لتقديم الروائح التي لا يمكن الوصول إليها خلاف ذلك بطريقة استنساخه.
إن طريقة عرض الرائحة ذات المدى البعيد الموصوفة هنا هامة فيما يتعلق بأساليب توصيل الرائحة الموجودة. فإنه يسمح مجموعة متنوعة من التطبيقات المستقبلية، بما في ذلك فحص أخرى لذوبان تقلبات للردود في أورن ليس فقط يضم في سنسيلا خندقية 1 ، ولكن تلك الموجودة في أي نوع سنسيلوم. يسمح الإجراء لتسليم فعالة من رائحة الفيرومون عن طريق نبض من الهواء بدلا من تحريك جسديا شعري زجاجي يحمل الروائح نحو هوائيات 6 . التعديل لدينا يقلل من إمكانية لمس الأنسجة مباشرة مع الزجاجية التي تحتوي على رائحة الشعرية، على النحو الذي تدعمه النتائج التجريبية التي لاحظنا استجابات بالميتوليك حمض استحثت إلا بعد أن سلمت نبض رائحة. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر أسلوبنا السيطرة الزمنية ممتازة من بداية رائحة السريع والإزاحة.
وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من الإمكانيات التي أظهرها الإجراء، فإنه لا يخلو من قيود. في الإجراء لدينا، وتحديد المواقع من خرطوشة تعتمد كليا على التكيف اليدوي، الأمر الذي يجعل من الصعب من الناحية الفنية لوضع خرطوشة مسبقاسيلي في نفس الموقع من المحاكمة إلى المحاكمة. وبالإضافة إلى ذلك، يلزم إيلاء اهتمام خاص للخطوات الحاسمة للبروتوكول لضمان تنفيذها بنجاح. في بعض الأحيان، واجهت استجابات متغيرة للغاية لتركيز رائحة معينة. في معظم الحالات، يرجع السبب إلى وضع خرطوشة غير متناسقة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن نلاحظ معايير اختيار صارمة ل at4 سنسيلا قبل التسجيل. أحجام ارتفاع at4A موحدة من ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء ( الشكل 3C ) هي المعيار الرئيسي، في حين أن معدل اطلاق القاعدية متواضع يشير إلى عدم وجود تلف الخلايا العصبية. درجة من الصعوبة التقنية لهذا الإجراء هو أكثر من يقابله قدرته على تقديم رائحة فرمون من النطاقات التي تحاكي عن كثب القرب لوحظ بين الذكور مغازلة والهدف الإناث.
باختصار، لدينا طريقة العرض الرائحة يوفر الوصول إلى حمض بالميتوليك للاستخدام في سر من أورنس أور 47b. ومع ذلك، فإن تطبيقهذه التقنية لا تقتصر على فرمون واحد، ولكن قابل للتكيف بسهولة إلى أي رائحة منخفضة تقلب أخرى من الاختيار، مما يجعلها تقنية تحليلية تنوعا عند فحص الروائح التي لا يمكن الوصول إليها سابقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر يي تشانغ للمساعدة في آثار عينة و تين كي تسانغ للمساعدة في الصور. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة راي توماس إدواردز جائزة الوظيفي المبكر ومنح المعاهد الوطنية للصحة (R01DC015519) إلى C.-يس والمنح المعاهد الوطنية للصحة (R01DC009597 و R01DK092640) ل جو
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50X objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
- Lin, H. -H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
