에서 전기 생리 학적 기록<em> Drosophila</em> 낮은 휘발성의 냄새에 반응하는 Trichoid Sensilla
Summary
이 프로토콜의 전반적인 목표는 장쇄 사상 페로몬에 반응하는 Drosophila 후각 수용체 뉴런으로부터 단일 감각 기록을위한 낮은 휘발성의 냄새 물질을 제시하는 방법을 입증하는 것입니다.
Abstract
곤충은 식량 구하기, 육식 동물 회피, 산란, 교미와 같이 생존에 필수적인 다양한 행동을 유도하기 위해 냄새 감각에 의존합니다. 다양한 휘발성 물질의 무수한 화학 물질이 곤충 후각 수용체 뉴런 (ORN)을 활성화시키는 천연 냄새 물질로 확인되었습니다. 그러나, 저 휘발성 냄새 물질에 대한 후각 반응을 연구하는 것은 종래의 악취 전달 방법을 사용하여 그러한 자극을 효과적으로 제공 할 수 없기 때문에 방해 받고있다. 여기서는 생체 내 Single-Sensillum Recording (SSR)을 위해 저 휘발성 취기 물질을 효과적으로 제시 할 수있는 절차에 대해 설명합니다. 냄새 소스와 표적 조직 사이의 거리를 최소화함으로써이 방법은 구토 및 교미 행동에 관여하는 ORN에 대한 효과가 입증 된 자극 페로몬 인 팔미 톨 레산 (palmitoleic acid)을 포함하여 생물학적으로 현저하지만 지금까지 접근 할 수없는 냄새 물질의 적용을 허용합니다 1 .따라서 우리의 절차는 곤충 반감 및 페로몬 커뮤니케이션에 대한 연구를 위해 저 휘발성 냄새 물질을 분석하는 새로운 방법을 제시합니다.
Introduction
Drosophila ORN은 에스테르, 알콜, 케톤, 락톤, 알데히드, 테르펜, 유기산, 아민, 황 화합물, 헤테로 고리 및 방향족 화합물을 포함하여 광범위한 탄소 사슬 길이와 다양한 작용기를 가진 방대한 냄새 물질에 반응합니다 2 , 3 . 그들의 물리 화학적 특성에있어서 다양한 냄새 물질은 화합물의 증기압에 의해 현저하게 상이한 휘발성을 나타낼 수있다. 특히, Drosophila melanogaster에 대한 생물학적으로 관련된 냄새 물질은 그들의 휘발성이 엄청나게 다릅니다. 예를 들어, Ir92a ORN은 휘발성이 높은 암모니아 4 에 20 ° C에서 6,432 mmHg의 증기압으로 반응합니다. 반대로 Or67d ORNs (VA c) 남성 페로몬, CIS -vaccenyl 아세트산 5, 6에 대응 증기압은 20 ℃에서 43 mmHg로한다.
ov_content "> 낮은 휘발성의 냄새에 대한 후각 반응을 연구하는 것은 냄새가 운반기 공기 흐름을 통해 상대적으로 장거리 ( 즉, 수 센티미터)에 걸쳐 전달되는 기존의 냄새 전달 방법에서 특히 어려움이 있습니다. 예를 들어, 고 선량의 c VA에 대한 Or67d ORN의보고 된 반응은 ~ 40 7 -> 200 spikes / s 6 범위에 해당합니다. 더욱이 전통적인 전달 방법을 이용한 c VA의 효과적이지 않은 전달은 잘못된 결과에 기인 할 가능성이 높기 때문에 c VA만으로 Or67d ORNs 8 을 활성화시키는 데 충분하지 않다는 해석으로 이어진다. 근거리 악취 전달 방법 9. 따라서 impera저 휘발성의 냄새를 효과적으로 표출 할 수있는 강력한 악취 전달 시스템을 개발하려고합니다.최근에 우리는 Or47b ORN의 리간드로서 몇몇 긴 사슬 큐티 릭 지방산을 확인했다. 그들은 유형 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4)에 있습니다. 장쇄 지방산 냄새 물질 중 Palmitoleic acid는 Or47b ORNs 1 을 활성화시킴으로써 남성 구애를 촉진시키는 최음 제지 페로몬으로서 기능한다는 것을 발견했다. 그러나, 종래의 악취 전달 방법을 사용하여 다른 연구에서, 메틸 라우 레이트가 동일한 거리 (10)로부터 제공 될 때 팔 미트 산 응답을 유발하지는 않지만 Or47b ORNs 응답을 유도하는 것으로 나타났다. VA C에 비해, 장쇄 지방산은 25 ° C 11 0.001 mmHg로는 증기압, 심지어 덜 휘발성이다. 장쇄 지방산 냄새의 본질적으로 낮은 휘발성은 안테나를 통한 효과적인 프리젠 테이션을 방해합니다.기존의 악취 전달 시스템은 위음성 결과를 설명 할 가능성이 높습니다 10 . 이러한 불일치는 저 휘발성 냄새 물질을 제시 할 때 기존의 악취 전달 시스템의 부적합 함을 강조합니다. 이것은 이전에 플라이 cuticular 냄새를 효과적으로 전달 악취 소스 및 대상 조직 (6) 사이의 근접을 요구하는 것이 도시되었다. 그들은 아마 성격 (12), (13)에 초파리에 의해 발생되는로부터의 거리를 모방, 우리는 최소한의 거리가 우리의 절차에 높은 우선 순위를 부여해야한다는 합의 동안 따라서, 완전히 생물학적 활성 페로몬의 효과를 특징입니다.
우리의 방법은 표준 전기 물리학 리그 및 기술과의 호환성을 포함하여 추가 이점을 보유합니다. 기존 장비 설치는이 프로토콜을 수용하기 위해 최소한의 수정 만 필요로하며 대부분의 SSR 단계는 사소한 조정 만 필요합니다. 이우리의 기술을 SSR 경험이있는 연구원이 쉽게 이용할 수있게합니다. 또한, 우리의 기술은 날카로운 발병 및 오프셋을 갖는 저 휘발성 냄새 물질의 제시를 허용하고, 신경 전달 반응과 자극 전달을 상관시킨다. 마지막으로, 하드웨어 레이아웃은 냄새 제거제 카트리지 간의 신속한 교환을 촉진하여 원하는 복용량 범위에서 데이터 수집을 신속하게 처리합니다.
우리는 참조 전극과 기록 전극, AHL (Adult Hemolymph-Like) 용액, 냄새 전달 카트리지 및 해당하는 감각 계의 준비를 검토합니다. 우리는 다음에 녹음을 위해 파리의 준비가 뒤따른 팔미 톨산 산 냄새 처리제의 준비에 대해 논의합니다. 우리는이 방법을 사용하여 얻은 대표 데이터를 제시하기 전에 냄새 제거제 카트리지의 위치를 기록하고 더 세밀하게 조사하기 위해 삼중 모양의 감각제를 선택하는 기준을 고려합니다. 마지막으로, 우리는이 techniq의 유용한 응용을 탐구하여 결론을 내린다.ue, 몇 가지 문제가 발생했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 or47b ORNs의 palmitoleic acid에 대한 반응을 강력하게 유도하고 기록 할 수있는 절차를 설명했다. 우리는 불충분 한 페로몬 냄새 전달 문제를 해결하기 위해 전통적인 장거리 냄새 전달 방법 2 , 7 , 10 을 변경했습니다. 우리는 냄새 제거제 카트리지를 통해 화합물을 전달함으로써 냄새 제거제의 낮은 휘발성 문제를 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
사진과 함께 도움을 주신 샘플 Trace와 Tin Ki Tsang의 도움으로 Ye Zhang에게 감사드립니다. 이 작품은 Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award와 C.-YS 및 NIH 교부금 (R01DC009597 및 R01DK092640)에 대한 NIH 교부금 (R01DC015519)에 의해 JWW에 지원되었습니다.
Materials
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50x objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
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