Elektrofizyolojik Kayıt<em> Drosophila</em> Düşük Volatilite Kokularına Karşı Trikoid Sensilla
Summary
Bu protokolün genel amacı, uzun zincirli kütiküler feromonlara tepki gösteren Drosophila olfaktör reseptör nöronlarından tek duyarlılık kaydı için düşük uçuculukta odorantları nasıl göstereceğini göstermektir.
Abstract
Böcekler, yiyecek arayışı, yırtıcılardan kaçınma, yumurta akı sağlığı ve çiftleşme gibi hayatta kalmaları için kritik olan geniş bir davranış yelpazesini yönlendirmek için koku duygularına güvenirler. Değişen uçuculuktaki sayısız kimyasal, böcek Koku Alıcısı Nöronlarını (ORNs) aktive eden doğal odorantlar olarak tanımlandı. Bununla birlikte, düşük uçuculuktan etkilenen odorantlara karşı olfaktör tepkiler üzerinde çalışmak, bu tür uyarıcı maddeleri geleneksel koku giderme yöntemlerini kullanarak etkin bir şekilde sunamamasından dolayı engellenmiştir. Burada, in – vivo Tek-Sensillum Kayıt (SSR) için düşük uçuculukta olan odorantların etkili bir şekilde sunumuna izin veren bir prosedürü açıklıyoruz. Koku kaynağı ile hedef doku arasındaki mesafeyi en aza indirerek, bu yöntem, palmitoleik asit, kur ve çiftleşme davranışı 1 'de yer ORNs üzerinde gösterilen etkisi olan bir uyarıcı feromon içeren biyolojik olarak çıkıntı ama şimdiye kadar ulaşılamayan koku, uygulama için izin verir.Prosedürümüz böcek kokusu ve feromon iletişimi için düşük volatiliteli bir odorantı test etmek için yeni bir yol sağlar.
Introduction
Drosophila ORNs, geniş çapta karbon zinciri uzunlukları ve esterler, alkoller, ketonlar, laktonlar, aldehitler, terpenler, organik asitler, aminler, kükürt bileşikleri, heterosiklikler ve aromatikler dahil olmak üzere çeşitli işlevsel gruplarla çok sayıda kokuya tepki verirler 2 , 3 . Fizikokimyasal özelliklerinde çeşitlilik gösteren koku maddeleri, bileşiğin buhar basıncı ile belirtilen belirgin derecede farklı uçuculuklara sahip olabilirler. Özellikle, Drosophila melanogaster için biyolojik açıdan önemli olan odorantlar, uçuculuklarında muazzam farklılıklar göstermektedir. Örneğin, Ir92a ORNs 20 ° C'de 6.432 mmHg buhar basıncı ile yüksek oranda uçucu olan amonyak 4'e tepki verir. Buna karşılık Or67d ORN'leri 20 ° C'de 43 mmHg buhar basıncı olan bir erkek feromon cis- vekseten asetat ( c VA) 5 , 6'ya cevap verir.
Düşük uçuculuktaki odorantlara karşı olfactory yanıtını incelemek, odorantların bir taşıyıcı hava akımı yoluyla nispeten uzun bir mesafe boyunca ( yani, birkaç santimetre) iletildiği klasik koku iletme yöntemleri ile özellikle zordur.Böylece, bildirilen koku yanıtları Koku giderme sisteminin tasarımına bağlı olarak, büyük oranda değişiklik gösterebilir Örneğin Or67d ORN'lerin yüksek bir c VA dozuna karşılık gelen yanıt, ~ 40 7 -> 200 çarpı / s 6 aralığındadır Ayrıca c VA'nın konvansiyonel verme yöntemleri ile etkisiz hale getirilmesi büyük olasılıkla sahte negatif sonuçlara neden olmakta ve bu da c VA'nın Or67d ORN'leri 8 harekete geçirmek için yeterli olmadığını yorumlamasına yol açmaktadır. Yakın menzilli koku iletme yöntemi 9. Bu nedenle imperaDüşük uçuculukta koku veren maddelerin etkin bir şekilde sunumu için sağlam bir koku iletim sistemi geliştirmek.Son zamanlarda, Or47b ORN'ler için ligandlar olarak birkaç uzun zincirli kekiküler yağ asitleri tespit ettik. Tip 4 Antenn Trichoid Sensillum'da (at4) yer alırlar. Uzun zincirli yağlı asit koku arasında, Or47b ORNs 1 etkinleştirerek erkek kur teşvik afrodizyak feromon olarak bu palmitoleik asit fonksiyonları bulundu. Bununla birlikte, geleneksel koku iletim yöntemini kullanan başka bir çalışmada, metil lauratın Or47b ORN'lerinden yanıtlar çıkardığı gösterilirken, palmitoleik asit, aynı mesafeden 10 sunulduğunda tepki vermedi. VA C ile kıyaslandığında, uzun zincirli yağ asitleri, 25 ° C'de 11 dan daha az 0,001 mm Hg buhar basınçları ile, daha az uçucu olan. Uzun zincirli yağlı asit odorantlarının doğal olarak düşük uçuculuğu, antene etkili sunumun önünü engeller;Geleneksel koku giderme sistemleri, muhtemelen sahte negatif sonuçlardan sorumluydu 10 . Bu tutarsızlık, düşük uçuculukta olan odorantları sunarken geleneksel koku iletim sistemlerinin yetersizliğini vurgular. Daha önce sinek cuticular kokuların etkili teslim koku kaynağı ve hedef dokuya 6 arasındaki yakınlığı gerektirdiğini gösterilmiştir. Bu nedenle, 12 , 13 doğadaki meyve sinekleri tarafından muhtemelen karşılaşılan mesafeyi taklit ederek biyolojik olarak aktif feromonların etkilerini tam olarak karakterize etmek için prosedürümüzde minimum mesafeye öncelik verilmesi gerektiği konusunda anlaşmıştık.
Metodumuz, standart elektrofizyoloji teçhizatları ve teknikleriyle uyumluluk da dahil olmak üzere diğer avantajları barındırır. Mevcut teçhizat kurulumları, bu protokolü barındırabilmek için minimal modifikasyon gerektirir ve çoğu SSR basamağı küçük ayarlamalar gerektirir. BuTekniğini SSR'de deneyimli araştırmacılar tarafından kolayca erişilebilir kılmaktadır. Ayrıca, tekniğimiz, uyaran iletimini nöronal yanıt ile ilişkilendirerek keskin başlangıçlı ve ofsetli düşük volatiliteli odorantların sunumuna izin verir. Sonunda, donanım yerleşimi, odorant kartuşları arasında hızlı alışveriş yapılmasını kolaylaştırarak, istenen bir doz aralığında veri toplamanın hızlandırılmasını sağlar.
Başvuru ve kayıt elektrotlarının, Yetişkin Hemolimf-Benzeri (AHL) çözeltinin, koku iletici kartuşların ve ilgili olfaktometre hazırlığının incelenmesi ile başlayacağız. Ardından, palmitoleik asit odorant solüsyonlarının hazırlanmasını ve ardından kayıt için sineğin hazırlanmasını tartışırız. Bu yöntemi kullanarak elde edilen temsili verileri sunmadan önce, odorant kartuşunun konumunu daha yakından kaydetmek ve daha yakından incelemek için trichoid sensillum seçme kriterlerini dikkate almaya devam ediyoruz. Son olarak, bu tekniğin faydalı uygulamaları keşfederek sonuçlandırıyoruzUe, bazı karşılaşılan sorunlar ve çözümleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada Or47b ORN'lerin palmitoleik aside verdiği yanıtların sağlam bir şekilde indükte edilebildiği ve kaydedilebildiği bir prosedürü açıkladık. Yetersiz feromon odorant verme sorununu gidermek için 2 , 7 , 10 numaralı geleneksel uzun mesafe koku alma yöntemini değiştirdik. Bileşimi, açılışları hazırlığın milimetre içinde konumlandırılmış olan odorant kartuşları vasıtasıyla dağıtarak d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Resimlerle ilgili yardım için örnek eserleri ve Tin Ki Tsang'a yardım için Ye Zhang'a teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Ray Thomas Edwards Vakfı Erken Kariyer Ödülü ve JWW'ye verilen C.-YS ve NIH hibelerine (R01DC009597 ve R01DK092640) NIH hibe (R01DC015519) tarafından desteklendi.
Materials
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50x objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
- Lin, H. -. H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -. I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
