Gravação eletrofisiológica de<em> Drosophila</em> Sensilla Tricoide em resposta aos odorantes de baixa volatilidade
Summary
O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como apresentar odorantes de baixa volatilidade para a gravação de sensibilidade única a partir de neurônios receptores olfativos de Drosophila que respondem a feromonas cuticulares de cadeia longa.
Abstract
Os insetos dependem do seu odor do sono para orientar uma ampla gama de comportamentos que são críticos para sua sobrevivência, como busca de alimentos, evasão de predadores, oviposição e acasalamento. Muitos produtos químicos de volatilidades variáveis foram identificados como odorantes naturais que ativam os neurônios de receptores olfatórios de insetos (ORNs). No entanto, o estudo das respostas olfativas a odorantes de baixa volatilidade foi dificultado pela incapacidade de apresentar efetivamente tais estímulos usando métodos convencionais de entrega de odor. Aqui, descrevemos um procedimento que permite a apresentação efetiva de odorantes de baixa volatilidade para a Gravação Single-Sensillum in vivo (SSR). Ao minimizar a distância entre a fonte de odor e o tecido alvo, este método permite a aplicação de odorantes biologicamente salientes, mas até então inacessíveis, incluindo o ácido palmitoleico, um feromônio estimulante com efeito demonstrado sobre ORN envolvidos no namoro e comportamento de acasalamento 1 .Nosso procedimento permite, assim, uma nova via para ensaiar uma série de odorantes de baixa volatilidade para o estudo da olfação de insetos e da comunicação de feromonas.
Introduction
As ORN de Drosophila respondem a um grande número de odorantes, com extensões de cadeia de carbono amplamente variadas e uma variedade de grupos funcionais, incluindo ésteres, álcoois, cetonas, lactonas, aldeídos, terpenos, ácidos orgânicos, aminas, compostos de enxofre, heterocíclicos e aromáticos 2 , 3 . Os odorantes variados em suas características físico-químicas podem ter volatilidades marcadamente diferentes, indicadas pela pressão de vapor do composto. Notavelmente, os odorantes biologicamente relevantes para Drosophila melanogaster diferem enormemente em sua volatilidade. Por exemplo, as ORN Ir92a respondem à amônia 4 , que é altamente volátil, com uma pressão de vapor de 6,432 mmHg a 20 ° C. Em contraste, Or67d ORN responde a um feromônio masculino, cis- acetato de vccencenilo ( c VA) 5 , 6 , cuja pressão de vapor é de 43 mmHg a 20 ° C.
Ove_content "> Estudar a resposta olfativa a odorantes de baixa volatilidade é particularmente desafiador com os métodos convencionais de entrega de odor, nos quais os odorantes são entregues através de um fluxo de ar transportador sobre uma distância relativamente longa ( ou seja, vários centímetros). Como tal, as respostas olfativas relatadas Para um determinado odorante de baixa volatilidade pode variar muito, dependendo do design do sistema de entrega de odor. Por exemplo, a resposta relatada de Or67d ORNs a uma dose elevada de c VA varia de ~ 40 7 -> 200 picos / s 6 Além disso, a entrega ineficaz de c VA com métodos de entrega convencionais provavelmente é atribuída a resultados falso-negativos, levando à interpretação de que c VA por si só não é suficiente para ativar Or67d ORNs 8. Essa interpretação foi posteriormente desafiada por outro estudo usando um odor método de entrega de curto alcance 9. é, por conseguinte, imperaPara desenvolver um sistema robusto de entrega de odor para a apresentação efetiva de odorantes de baixa volatilidade.Recentemente, identificamos vários ácidos graxos cuticulares de cadeia longa como ligandos para Or47b ORNs. Eles estão alojados no tipo 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Entre os odorantes de ácidos graxos de cadeia longa, descobrimos que o ácido palmitoleico funciona como um feromônio afrodisíaco que promove o namoro masculino ativando Or47b ORNs 1 . No entanto, em outro estudo usando um método de entrega de odor convencional, o laurate de metilo mostrou provocar respostas de Or47b ORNs, enquanto que o ácido palmitoleico não provocou resposta quando apresentado a partir da mesma distância 10 . Em comparação com c VA, os ácidos gordurosos de cadeia longa são ainda menos voláteis, com pressões de vapor inferiores a 0,001 mmHg a 25 ° C 11 . A baixa volatilidade intrínseca de odorantes de ácidos graxos de cadeia longa, que impede a apresentação eficiente à antena viaSistemas convencionais de entrega de odor, provavelmente representaram os resultados falso-negativos 10 . Esta inconsistência destaca a inadequação dos sistemas convencionais de entrega de odor na apresentação de odorantes de baixa volatilidade. Foi anteriormente demonstrado que a entrega efetiva de odores cuticulares de mosca requer proximidade próxima entre a fonte de odor e o tecido alvo 6 . Assim, para caracterizar completamente os efeitos das feromonas biologicamente ativas, imitando a distância a partir da qual provavelmente são encontradas pelas moscas da fruta na natureza 12 , 13 , concordamos que a distância mínima deve ser dada prioridade em nosso procedimento.
Nosso método possui outras vantagens, incluindo a compatibilidade com plataformas e técnicas de eletrofisiologia padrão. Configurações de plataforma pré-existentes requerem modificações mínimas para acomodar este protocolo, e a maioria das etapas de SSR requerem apenas pequenos ajustes. esteTorna nossa técnica prontamente acessível para pesquisadores experientes em SSR. Além disso, nossa técnica permite a apresentação de odorantes de baixa volatilidade com início e deslocamento nítidos, correlacionando o estímulo com a resposta neuronal. Finalmente, o layout de hardware facilita trocas rápidas entre cartuchos odorantes, agilizando a coleta de dados em uma faixa de dosagem desejada.
Começamos por revisar a preparação de eletrodos de referência e de gravação, solução de Hemolinflamadinha Adulto (AHL), cartuchos de entrega de odorantes e o correspondente olfatômetro. Em seguida, discutimos a preparação das soluções de odorantes com ácido palmitoleico, seguido da preparação da mosca para gravação. Continuamos a considerar os critérios para a seleção de um sensil trichoid para registrar e examinar mais de perto o posicionamento do cartucho odorante antes de apresentar dados representativos adquiridos usando este método. Finalmente, concluimos explorando aplicações úteis desta técnicaAlguns problemas encontrados e suas soluções.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um procedimento pelo qual as respostas de Or47b ORNs ao ácido palmitoleico podem ser induzidas e registradas de forma robusta. Modificamos um método convencional de entrega de odor de longa distância 2 , 7 , 10 para solucionar o problema da entrega insuficiente de odorantes de feromonas. Abordamos a questão da baixa volatilidade odorante através da entrega do composto através de cartuchos odorantes, cuja…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Ye Zhang pela ajuda com os traços da amostra e Tin Ki Tsang pela ajuda com as imagens. Este trabalho foi apoiado por um Prêmio de Carreira Antecipada da Fundação Ray Thomas Edwards e uma concessão NIH (R01DC015519) para concessões de C.-YS e NIH (R01DC009597 e R01DK092640) para JWW
Materials
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50x objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
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