Registrazione elettrofisiologica da<em> Drosophila</em> Senso Trichoide in risposta a Odoranti di bassa volatilità
Summary
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare come presentare gli odoranti a bassa volatilità per la registrazione singolo-sensillare da parte dei neuroni del recettore olfattivo Drosophila che rispondono ai feromoni cuticolari a catena lunga.
Abstract
Gli insetti si affidano al loro senso di odore per guidare una vasta gamma di comportamenti critici per la loro sopravvivenza, come la ricerca di cibo, l'evasione dei predatori, l'oviposizione e l'accoppiamento. Le sostanze chimiche di varie volatilità variabili sono state identificate come odoranti naturali che attivano gli insetti del recettore del olfattivo (ORN). Tuttavia, studiare le risposte olfattive agli odoranti a bassa volatilità è stato ostacolato dall'incapacità di effettivamente presentare tali stimoli usando metodi convenzionali di erogazione. Qui descriviamo una procedura che consente la presentazione efficace di odoranti a bassa volatilità per la registrazione in singola sensillazione in vivo (SSR). Minimizzando la distanza tra l'origine dell'odore e il tessuto bersaglio, questo metodo consente l'applicazione di odori biologicamente salienti ma finora inaccessibili, compreso l'acido palmitoleico, un feromone stimolante con un effetto dimostrato sugli ORN coinvolti nel corteggiamento e nel comportamento di accoppiamento 1 .La nostra procedura offre quindi un nuovo modo di analizzare una serie di odoranti a bassa volatilità per lo studio dell'intelligenza degli insetti e della comunicazione feromonica.
Introduction
Gli ORN di Drosophila rispondono ad un vasto numero di odoranti, con lunghezze lunghe di catene di carbonio e vari gruppi funzionali, inclusi esteri, alcoli, chetoni, lattoni, aldeidi, terpeni, acidi organici, ammine, composti di zolfo, eterocicli e aromi 2 , 3 . Gli odoranti variati nelle loro caratteristiche fisico-chimiche possono avere volatilità notevolmente diverse, indicati dalla pressione del vapore del composto. In particolare, gli odoranti biologicamente rilevanti per Drosophila melanogaster differiscono tremendamente nella loro volatilità. Ad esempio, i ORN di Ir92a rispondono ad ammoniaca 4 , altamente volatile, con una pressione di vapore di 6.432 mmHg a 20 ° C. Al contrario, Or67d ORN risponde a un feromone maschio, cis- Vaccenil acetato ( c VA) 5 , 6 , la cui pressione vapore è di 43 mmHg a 20 ° C.
Ove_content "> Studiare la risposta olfattiva agli odoranti a bassa volatilità è particolarmente impegnativa con i metodi convenzionali di erogazione, in cui gli odoranti vengono consegnati attraverso un flusso d'aria di supporto su una distanza relativamente lunga ( cioè diversi centimetri), in quanto tali le risposte olfattive riportate Ad un determinato odorante a bassa volatilità può variare notevolmente, a seconda della progettazione del sistema di erogazione. Ad esempio, la risposta riportata di Or67d ORN ad un'elevata dose di c VA va da ~ 40 7 -> 200 picchi / s 6 Inoltre, l'inefficace consegna di c VA con metodi di consegna convenzionali è probabilmente attribuita a risultati falsi negativi, portando all'interpretazione che c VA di per sé non è sufficiente ad attivare OR67d ORNs 8. Questa interpretazione fu successivamente contestata da un altro studio che utilizza un Metodo di erogazione di odore a distanza ravvicinata 9. È quindi imperaPer sviluppare un sistema di erogazione robusto per la presentazione efficace di odoranti a bassa volatilità.Recentemente, abbiamo identificato diversi acidi grassi cuticolari a catena lunga come ligandi per Or47b ORNs. Sono alloggiati nel tipo 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Fra gli odoranti di acido grasso a lunga catena, abbiamo scoperto che l'acido palmitoleico funziona come un feromone afrodisiaco che promuove il corteggiamento maschile attivando Or47b ORNs 1 . Tuttavia, in un altro studio che utilizza un metodo di consegna convenzionale di odore, è stato dimostrato che la laurate di metile provocava risposte da OR47b ORN, mentre l'acido palmitoleico non ha generato risposta se viene presentata dalla stessa distanza 10 . Rispetto a c VA, gli acidi grassi a catena lunga sono ancora meno volatili, con pressioni di vapore inferiori a 0,001 mmHg a 25 ° C 11 . La volatilità intrinsecamente bassa di odoranti di acido grasso a catena lunga, che impedisce un'efficace presentazione all'antenna viaSistemi di consegna convenzionali, probabilmente rappresentavano i risultati falsi negativi 10 . Questa incoerenza evidenzia l'inadeguatezza dei sistemi convenzionali di erogazione in presenza di odoranti a bassa volatilità. È stato dimostrato in precedenza che l'efficace erogazione di odori cuticolari di mosca richiede una stretta vicinanza tra l'origine dell'odore e il tessuto bersaglio 6 . Pertanto, per caratterizzare in modo completo gli effetti dei feromoni biologicamente attivi, imitando la distanza da cui sono probabilmente incontrati dalle mosche di frutta nella natura 12 , 13 , abbiamo convenuto che la distanza minima deve essere accordata ad alta priorità nella nostra procedura.
Il nostro metodo offre ulteriori vantaggi, compresa la compatibilità con le righe e le tecniche di elettrofisiologia standard. Le impostazioni preliminari di rigature richiedono una modifica minima per ospitare questo protocollo e la maggior parte dei passaggi SSR richiedono solo piccole regolazioni. QuestoRende la nostra tecnica facilmente accessibile ai ricercatori esperti in SSR. Inoltre, la nostra tecnica consente la presentazione di odoranti a bassa volatilità con instabilità e offset, correlando la distribuzione dello stimolo con la risposta neuronale. Infine, il layout hardware facilita gli scambi rapidi tra le cartucce odoranti, accelerando la raccolta dei dati su un intervallo di dosaggio desiderato.
Iniziamo esaminando la preparazione di elettrodi di riferimento e di registrazione, soluzione adulti Hemolymph-Like (AHL), cartucce di erogazione odoranti e il corrispondente olfattometro. Discuteremo poi la preparazione delle soluzioni odoranti dell'acido palmitoleico, seguita dalla preparazione della mosca per la registrazione. Continuiamo a considerare i criteri per la selezione di un sensitivo trichoide per registrare e esaminare più approfonditamente il posizionamento della cartuccia odorante prima di presentare i dati rappresentativi acquisiti utilizzando questo metodo. Infine, concludiamo esplorando le applicazioni utili di questa tecnicaUe, alcuni problemi incontrati e le loro soluzioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo descritto una procedura con la quale le risposte di Or47b ORNs all'acido palmitoleico possono essere indotti e registrati in modo robusto. Abbiamo modificato un metodo convenzionale per la distribuzione di odori a lunga distanza 2 , 7 , 10 per risolvere il problema della mancanza di erogazione di feromoni. Abbiamo affrontato il problema della bassa volatilità odorante consegnando il composto tramite cartucce od…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Ye Zhang per l'aiuto con le tracce del campione e Tin Ki Tsang per l'aiuto con le immagini. Questo lavoro è stato sostenuto da un premio di premio della Fondazione Ray Thomas Edwards e da una sovvenzione di NIH (R01DC015519) ai contributi di C.-YS e NIH (R01DC009597 e R01DK092640) a JWW
Materials
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50x objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
- Lin, H. -. H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -. I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
