Elektrofysiologisk optagelse fra<em> Drosophila</em> Trichoid Sensilla som reaktion på lugtstoffer med lav volatilitet
Summary
Det overordnede mål med denne protokol er at demonstrere, hvordan man præsenterer lugtstoffer med lav volatilitet til single-sensillumoptagelse fra Drosophila- olfaktoriske receptorneuroner, der reagerer på langkædede kutikulære feromoner.
Abstract
Insekter er afhængige af deres lugtesans til at lede en bred vifte af adfærd, der er afgørende for deres overlevelse, såsom madforsøg, rovdyr undgås, oviposition og parring. Myriade kemikalier med varierende volatiliteter er blevet identificeret som naturlige lugtstoffer, som aktiverer insekt Olfactory Receptor Neurons (ORNs). Undersøgelse af de olfaktoriske reaktioner på lavvolatilitets lugtstoffer er imidlertid blevet hæmmet af en manglende evne til effektivt at præsentere sådanne stimuli ved anvendelse af konventionelle lugtleveringsmetoder. Her beskriver vi en procedure, som muliggør den effektive præsentation af lugtstoffer med lav volatilitet til in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). Ved at minimere afstanden mellem lugtkilden og målvævet muliggør denne fremgangsmåde anvendelsen af biologisk fremherskende, men hidtil utilgængelige lugtstoffer, herunder palmitolsyre, et stimulerende feromon med en påvist virkning på ORN'er involveret i frieri og parringsadfærd 1 .Vores procedure giver således en ny vej til at analysere en lang række flygtige lugtstoffer til undersøgelse af insektopfatning og feromontommunikation.
Introduction
Drosophila ORN'er reagerer på et stort antal lugtstoffer med vidtrækkende carbonkædelængder og en række funktionelle grupper, herunder estere, alkoholer, ketoner, lactoner, aldehyder, terpener, organiske syrer, aminer, svovlforbindelser, heterocykliske forbindelser og aromater 2 , 3 . Lugtstoffer varieret i deres fysisk-kemiske egenskaber kan have markant forskellige volatiliteter, angivet ved damptrykket af forbindelsen. Især biologisk relevante lugtstoffer til Drosophila melanogaster adskiller sig enormt i deres volatilitet. For eksempel reagerer Ir92a-ORN'er på ammoniak 4 , som er stærkt flygtig, med et damptryk på 6.432 mmHg ved 20 ° C. I modsætning hertil reagerer Or67d ORN'er på en male feromon, cis- vaccenylacetat ( c VA) 5 , 6 , hvis damptryk er 43 mmHg ved 20 ° C.
Ove_content "> Undersøgelse af det olfaktoriske svar på lugtstoffer med lav volatilitet er særlig udfordrende med konventionelle lugtleveringsmetoder, hvor lugtstoffer leveres via en luftbærer fra luften over en relativt lang afstand ( dvs. flere centimeter). Som sådan er de rapporterede olfaktoriske reaktioner Til en given lavvolatilitets lugtstof kan variere meget afhængigt af udformningen af lugtafgivelsessystemet. For eksempel varierer det rapporterede respons af Or67d ORN til en høj dosis c VA fra ~ 40 7 -> 200 pigge / s 6 . Desuden tilskrives den ineffektive levering af c VA med konventionelle leveringsmetoder sandsynligvis falske negative resultater, hvilket fører til den fortolkning, at c VA i sig selv ikke er tilstrækkelig til at aktivere Or67d ORN 8. Denne fortolkning blev senere udfordret af en anden undersøgelse ved anvendelse af en Lukke-afleveringsmetode 9. Det er derfor imperaUdvikle et robust lugtafgivelsessystem til effektiv præsentation af lugtstoffer med lav volatilitet.For nylig identificerede vi adskillige langkædede kutikulære fedtsyrer som ligander for Or47b ORN'er. De er anbragt i type 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Blandt de langkædede fedtsyre-lugtstoffer fandt vi, at palmitolsyre fungerer som et afrodisiakum feromon, der fremmer mandlige frieri ved at aktivere Or47b ORNs 1 . I en anden undersøgelse ved anvendelse af en konventionel lugt-leveringsmetode viste methyllaurat imidlertid at fremkalde respons fra Or47b ORN'er, mens palmitolsyre fremkaldte intet svar, når de blev præsenteret fra samme afstand 10 . Sammenlignet med c VA er langkædede fedtsyrer endnu mindre flygtige, med damptryk mindre end 0,001 mmHg ved 25 ° C 11 . Den iboende lave volatilitet af langkædede fedtsyre lugtstoffer, som udelukker effektiv præsentation til antennen viaKonventionelle lugtafgivelsessystemer, som sandsynligvis tegnede sig for de falsk negative resultater 10 . Denne uoverensstemmelse fremhæver utilstrækkeligheden af konventionelle lugtafgivelsessystemer ved fremlæggelse af lavvolatilitets lugtstoffer. Det blev tidligere vist, at den effektive afgivelse af fly-cutikulære lugt kræver tæt nærhed mellem lugtkilden og målvævet 6 . For at fuldt ud karakterisere virkningerne af biologisk aktive feromoner, mens vi efterligner afstanden fra hvilke de sandsynligvis stødes af frugtfly i naturen 12 , 13 , blev vi enige om, at minimal afstand skal gives høj prioritet i vores procedure.
Vores metode indeholder yderligere fordele, herunder kompatibilitet med standard elektrofysiologi rigge og teknikker. Forudgående riggopsætninger kræver minimal ændring for at rumme denne protokol, og de fleste SSR-trin kræver kun mindre justeringer. Det herGør vores teknik let tilgængelig for forskere med erfaring i SSR. Desuden giver vores teknik mulighed for præsentation af lav-volatilitet lugtstoffer med skarpe start og offset, korrelerende stimulus levering med neuronal respons. Endelig letter hardwarelayoutet hurtige udvekslinger mellem lugtpatroner og fremskynder dataindsamling over et ønsket doseringsområde.
Vi begynder med at gennemgå forberedelsen af reference- og registreringselektroder, Voksne Hemolymph-Like (AHL) -opløsning, Lugtdrivpatroner og det tilsvarende olfaktometer. Vi diskuterer derefter forberedelsen af palmitolsyre lugtopløsningerne, efterfulgt af forberedelsen af fluen til optagelse. Vi fortsætter med at overveje kriterierne for udvælgelse af et trichoid sensillum til registrering og nærmere undersøgelse af lugtpatronens positionering, inden vi præsenterer repræsentative data, der er erhvervet ved hjælp af denne metode. Endelig konkluderer vi ved at udforske nyttige anvendelser af denne teknikUe, nogle stødte problemer og deres løsninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi en procedure, hvorved svarene fra Or47b ORN'er til palmitolsyre kan induceres og registreres robust. Vi ændrede en konventionel langdistance lugt leveringsmetode 2 , 7 , 10 for at fejle problemet med utilstrækkelig feromon lugtstof levering. Vi behandlede spørgsmålet om lav lugtfluiditet ved at levere forbindelsen via lugtpatroner, hvis åbning er placeret inden for millimeter af præparatet. Når der tag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Ye Zhang for hjælp med stikprøverne og Tin Ki Tsang for hjælp med billederne. Dette arbejde blev støttet af en Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award og et NIH-tilskud (R01DC015519) til C.-YS og NIH-tilskud (R01DC009597 og R01DK092640) til JWW
Materials
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50x objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
- Lin, H. -. H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -. I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
