يصف لنا هنا مقايسة الخلية الحرة بيوكيميائية فلوروميتريك للبت في هدل-وبيروكسيد. هذا الفحص السريع واستنساخه يمكن استخدامها لتحديد دالة الحميد في دراسات واسعة النطاق، ويمكن أن تسهم في فهمنا للدالة الكوليسترول الجيد في الأمراض التي تصيب البشر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الخلية الحرة البيوكيميائية المقايسة الانزيمية فلوروميتريك لقياس الفائق وبيروكسيد في البروتين الدهني العالي الكثافة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مستويات الكوليسترول في الدم (HDL-C) منخفض الكثافة lipoprotein واحدة من تنبؤ السلبية مستقلة أقوى من أمراض القلب والأوعية الدموية تصلب الشرايين (الرسوم التعويضية). هيكل ووظيفة الحميد بدلاً من HDL-C يمكن التنبؤ بدقة أكثر تصلب الشرايين. تحدث عدة الحميد البروتين والدهن التغييرات التركيبية التي تنال من الدالة الحميد في الولايات الملتهبة مثل تصلب الشرايين. الدالة الحميد يتحدد عادة بالخلية على أساس فحوصات مثل الإنزيم افلوكس نسبة الكولسترول في الدم ولكن هذه الاختبارات لها عدة عيوب عدم توحيد. فحوصات مجانية من الخلية قد تعطي تدابير أقوى الحميد وظيفة مقارنة بفحوصات يستند إلى الخلية. ويضعف أكسدة الحميد الحميد الدالة. الحميد دوراً رئيسيا في النقل بيروكسايد المادة الدهنية وهي المتعلقة بكمية عالية من الدهون الأكاسيد الفوقية الشاذ الحميد الدالة. ينبغي النظر في التفاعلات الدهن-التحقيق عند تفسير نتائج الأسفار غير الانزيمية فحوصات لقياس حالة الأكسدة الدهنية. وهذا دافع لنا لتطوير أسلوب الانزيمية الخلية الحرة بيوكيميائية لتقييم الحميد بيروكسايد محتوى الدهون (هدلوكس) أن يسهم في الخلل الوظيفي الحميد. يستند هذا الأسلوب على البيروكسيديز الفجل إنزيم (HRP) و fluorochrome Amplex الأحمر التي يمكن تحديدها كمياً (بدون الكوليسترول أوكسيديز) محتوى الدهن بيروكسايد كل مغ من HDL-C. هنا بروتوكول تحديد ديسكريبيدفور HDL-وبيروكسيد استخدام الكاشف فلوروتشرومي. يمكن الحد من تقلب المقايسة بالتوحيد الصارم للظروف التجريبية. أعلى هدلوكس القيم المرتبطة بانخفاض وظيفة المضادة للأكسدة الكوليسترول الجيد. قراءات من هذا التحليل المقترنة مع قراءات لفحوصات المستندة إلى خلية تم التحقق من صحتها، تدابير بديلة لأمراض القلب والأوعية الدموية والتهاب النظامية والخلل المناعي وتعمل يرتبط بها من مخاطر القلب والأوعية الدموية والايض. وهذا النهج التقني هو وسيلة قوية لتقييم دالة الكوليسترول الجيد في الأمراض البشرية فيها التهاب النظامية والأكسدة والدهون المؤكسدة لها دور رئيسي (مثل تصلب الشرايين).
المقدمة
أمراض القلب والأوعية الدموية تصلب الشرايين (الرسوم التعويضية) هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم1،2. وقد أظهرت الدراسات الوبائية أن انخفاض مستويات البروتين الدهني الكثافة (HDL) الكوليسترول عموما ترتبط عكسيا مع المخاطر لتطوير تصلب الشرايين1،2. على الرغم من اعتماد العديد من الدراسات بدور أثيروبروتيكتيفي الحميد1،2، هو الآلية التي يخفف الحميد بدء وتطور تصلب الشرايين معقدة 3،4. ومن ثم، اقترح أن هيكل معقد ووظيفة الحميد بدلاً من المس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت جميع التجارب باستخدام العينات البيولوجية البشرية بموافقة الأخلاق من الجامعة "كاليفورنيا لوس أنجليس"، ولوس أنجليس ولجنة "الأخلاقيات البشرية مستشفى الفريد"، ملبورن.
ملاحظة: هناك العديد من الاختلافات الدالة fluorochrome الحميد المقايسة (انظر المناقشة) 32. أدناه ونحن سوف تصف البروتوكول الذي يعطي نتائج أكثر اتساقا واستنساخه. نظرة عامة التحليل ويبين الشكل 2-
1-"تجهيز العينة"
المصل طازجة وغير هيموليزيد- الاستخدام (يمكن جمعها في أنابيب فاصل المصل) أو سترات البلازما التي تم الحصول عليها بعد 12-14 ساعة صيام. في حالة استخدام عينات cryopreserved، تتضمن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم إضافة 50 ميليلتر من كل عينة الحميد في كل بئر كما في الخطوة 7، 3. 50 ميليلتر من حل HRP 5 يو/مليلتر (0.25 U) ثم تضاف إلى كل جيدا كما هو الحال في الخطوة 7، 5. هي المحتضنة عينات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية كما هو الحال في الخطوة 7، 6. ثم تتم إضافة 50 ميليلتر من كاشف فلوروتشرومي في كل بئر كما في الخطوة 7.7 (تركيز النهائية من 300 ميكرون). ويتم تقييم قراءات الفلورسنت (في الظلام) ثم كل دقيقة أكثر من 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع قارئ لوحة نيون (530/590 nm مرشحات). الأسفار تمثيلية البيانا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويوفر البروتوكول الموصوفة هنا أداة قوية للإجابة على الأسئلة البحثية الهامة فيما يتعلق بالدور وظيفة الحميد في تصلب الشرايين، والأمراض التي تصيب البشر. يوضحها المقايسة محتوى الدهن الحميد بيروكسايد كل مغ من HDL-C باستخدام التضخيم الانزيمية (HRP). ويتجنب هذا النهج القيود المعروفة لفحوصات وظيفة الحميد السابقة (مثل فحص الكولسترول efflux) بما في ذلك تغايرية مهمة فيما يتعلق بأنواع الخلايا المستخدمة ونوع من قراءات وأفادت، والافتقار إلى التوحيد وآثار الخلط الثلاثية7،،من
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
هذا البروتوكول والمقايسة ذات الصلة بالبراءات PCT/US2015/018147.
شكر وتقدير
الكتاب امتنان الاعتراف بالعمل للدكتور محمد نافاب والن فوغلمان ريدي سرينفاسا لدورها الرئيسي في تنمية تكرارات السابقة من هذا الطراز. T.A.A. معتمد من قبل معهد ملبورن الملكي الجامعة نائب مدير الجامعة "زمالات ما بعد الدكتوراه". جعفر و AH معتمدة بتمويل المشروع منحة 1108792. معتمد المعارف التقليدية التي تمنح K08AI08272 المعاهد الوطنية للصحة، "منح" المعاهد الوطنية للصحة/نكتس # µL1TR000124 من المعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > كواشف تجريبية < / قوي > HDL | |||
| PEG (البولي إيثيلين جلايكول) كاشف مرسب | بوانت Scientific | H7511 | |
| كاشف أحمر Amplex. | Life Technologies ، Grand Island ، NY | A12216 | Amplex لفحص الكوليسترول الأحمر Kit. & & le ؛ – 20 درجة ؛ ج & المجفف & الحماية من الضوء |
| DMSO. | Life Technologies ، Grand Island ، NY | A12216 | Amplex لفحص الكوليسترول الأحمر Kit. & & le ؛ – 20 درجة ؛ ج & المجفف & الحماية من |
| فجل الحصان الخفيف بيروكسيداز (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. & & le; – 20 درجة ؛ ج & المجفف & يحمي من |
| إستيراز الكوليسترول الخفيف. | Life Technologies ، Grand Island ، NY | A12216 | Amplex لفحص الكوليسترول الأحمر Kit. & & le ؛ – 20 درجة ؛ ج & المجفف & الحماية من ضوء |
| الكوليسترول المرجعي القياسي | Life Technologies ، Grand Island ، NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. & & le; – 20 درجة ؛ ج & المجفف & الحماية من الضوء |
| Resorufin fluorescense المرجعي القياسي | Life Technologies ، Grand Island ، NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. & bull & le. – 20 درجة ؛ ج & المجفف & حماية من الضوء |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies ، Grand Island ، NY | A12216 | Amplex لفحص الكوليسترول الأحمر Kit. & & le ؛ – 20 درجة ؛ ج & المجفف & حماية من الضوء |
| كاشف الكوليسترول الآلي HDL | ThermoFisher Scientific Co. ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية. | TR39601 | |
| <قوي>الاسم | <قوي>الشركة | رقم الكتالوج | تعليقات |
| Plasticware | |||
| 96-well (بولي بروبيلين، قاع مسطح، شفاف). | ألواح Sigma Aldrich | M0687 | |
| ذات 96 بئرا (بولي بروبيلين ، قاع مسطح ، أسود). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 مل أنابيب Eppendorf | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200 ، شركة | ThermoFisher Scientific المعقمة ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية. | 14-488-058 | |
| ماصات Thermo Scientific متعددة القنوات ، 8 قنوات ، 125 ؛ | شركة ThermoFisher Scientific Co. ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية. | 14-387--955 | |
| name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 Software | Biotek، فيرمونت، الولايات المتحدة الأمريكية | NA | |
| strong>Name | الشركة< / strong> | رقم الكتالوج < / strong> | التعليقات < / strong> |
| Equipment < / strong> | |||
| Gen5 قارئ لوحة | Biotek ، فيرمونت ، الولايات المتحدة الأمريكية | NA |
المراجع
- Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
- Rubins, H. B., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
