ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה
Summary
נתאר כאן fluorometric assay ללא תא הביוכימי לקביעת ה-HDL-השומנים peroxidation. זה מהיר ולא לשחזור assay יכול לשמש כדי לקבוע פונקציה HDL במחקרים בקנה מידה גדול והוא יכול לתרום להבנת פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות.
Abstract
רמות הכולסטרול (HDL-C) ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה נמוך הם אחד החזקים ביותר מנבאות שלילי עצמאית של מחלות לב וכלי דם טרשת עורקים (CVD). המבנה והתפקוד של HDL יותר מאשר ה-HDL-C אולי יותר לחזות במדויק טרשת עורקים. מספר ה-HDL חלבון ו ליפיד ההלחנה שינויים שפוגעים פונקציית ה-HDL להתרחש במצבים דלקתיים כגון טרשת עורקים. פונקציית ה-HDL נקבעת בדרך כלל לפי תא מבוסס מבחני כגון כולסטרול בזרימת assay אבל אלה מבחני יש חסרונות רבים, היעדר סטנדרטיזציה. מבחני ללא תא עשוי לתת באמצעים חזקים יותר של פונקציית ה-HDL לעומת מבחני מבוססת-תא. HDL חמצון פוגע פונקציית ה-HDL. HDL יש תפקיד מרכזי בהעברה חמצן השומנים, כמות גבוהה של שומנים בדם משתכים שטח ניקוי קשורה לתפקוד נורמלי של HDL. השומנים-בדיקה אינטראקציות להתייחס כאשר מבחני הנמצאות לפרש את התוצאות של זריחה אנזימטי למדידת מצב חמצון השומנים. זה הניע אותנו לפתח שיטה אנזימטי ללא תא ביוכימי כדי להעריך את ה-HDL חמצן תוכן שומני (HDLox) אשר תורם בתפקוד ה-HDL. שיטה זו מבוססת על peroxidase חזרת את האנזים (HRP) ו fluorochrome את אדום Amplex אשר יכולים לכמת (ללא כולסטרול אוקסידאז) את השומנים התוכן חמצן לכל מ”ג של ה-HDL-C. פרוטוקול זה קביעת describedfor peroxidation HDL-השומנים באמצעות הכימית fluorochrome. השתנות assay יכול להיות מופחת על ידי סטנדרטיזציה קפדנית של תנאי הניסוי. ערכים גבוהים יותר HDLox משויכות פונקציה מופחתת של נוגדי חמצון HDL. Readout assay זו משויכת המפרט של המאומת מבוססת תא מבחני, הפונדקאית אמצעים של מחלות לב וכלי דם, דלקת מערכתית, תפקוד המערכת החיסונית פנוטיפים סיכון קרדיו-וסקולריות ושל מטבולית המשויך. גישה טכנית זו היא שיטה חזקה כדי להעריך פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות בו דלקת מערכתית, סטרס חמצוני ושומנים מחמצנים יש תפקיד מפתח (כגון טרשת עורקים).
Introduction
מחלות לב וכלי דם טרשת עורקים (CVD) הוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם1,2. מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי רמות נמוכות של כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) המשויכים בדרך כלל הפוך הסיכון להתפתחות טרשת עורקים1,2. למרות מספר מחקרים תומכים תפקיד atheroprotective עבור ה-HDL1,2, המנגנון שבאמצעותו HDL נחלש החניכה, ההתקדמות של טרשת עורקים הוא מורכב 3,4. לפיכך, הוצע כי מורכבות המבנה והתפקוד של HDL ולא רמה מוחלטת עלולה יותר לחזות במדויק טרשת עורקים 5,6,7,8. מספר ה-HDL חלבון ו ליפיד ההלחנה שינויים שפוגעים פונקציית ה-HDL להתרחש במצבים דלקתיים כגון טרשת עורקים. אלו i) להפחית את פוטנציאל בזרימת 9שלה כולסטרול, ii) ירידה אנטי דלקתיות, ולהגביר את ה-HDL-הקשורים חלבונים פרו דלקתיים 6,7, של רמות פקטור של ירידה iii) נוגד חמצון ופעילות ו HDLs היכולת לעכב את חמצון של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLox)10 ו- iv) להגדיל את השומנים hydroperoxide התוכן של חמצון-חיזור פעילות (HDLox)9,11. מבחני חזקים להעריך את הפונקציות pleotropic של ה-HDL (כגון כולסטרול בזרימת, נוגד חמצון פונקציה) ייתכן משלימים נחישות של HDL-HDL-C במרפאה.
פונקציית ה-HDL הוא בדרך כלל לאומדן מבוססת תא שיטות כגון כולסטרול בזרימת assay8,12,13,14. שיטות אלה יש מגבלות הגדולות כולל הטרוגניות משמעותי לגבי סוגים של תאים בשימוש, סוג הבדיקה דיווח, היעדר סטנדרטיזציה ואפקטים מבלבלים של טריגליצרידים 7,15. מחסרונות אלה מהווים קשיים על מחקרים קליניים גדולים16. מבחני ללא תא עשוי לתת באמצעים חזקים יותר של פונקציית ה-HDL לעומת מבחני מבוססת-תא. בזרימת כולסטרול הוא אחד התפקידים החשובים ביותר של ה-HDL, אך זה יכול להיקבע רק על ידי מבחני מבוססת-תא. גישות אחרות כדי לקבוע את פונקציית ה-HDL כגון פרוטאומיקס17,18,19,20,21,22,23, 24 , מונוציט מבוססת תא מבחני כימוטקסיס של HDL פונקציה 17,22,25 לא סטנדרטית ואין אפשרות להשתמש במחקרים בבני אדם בקנה מידה גדול.
HDL יש נוגד חמצון משמעותית atheroprotective אפקט5,6,7,8. הפונקציה נוגד חמצון של HDL נקבע בנוכחות LDL לתא הקודם חינם מבחני fluorometric 26. השיטות fluorometric הביוכימי של HDL נוגד חמצון פונקציה פותחו במקור מאת פרהיוט אבבה Navab, אלן פוגלמן, הקולגות שלהם26. למרות מחקרים בבני אדם רבים השתמשו בשיטות אלה כדי לקבוע את ה-HDL פונקציה 17,18,19,20,21,22,23 ,24, השומנים (HDL)-שומנים בדם (LDL) ואינטראקציות השומנים-fluorochrome עלולה להגביל הפארמצבטית של אלה תא חינם-אנזימטי הביוכימי מבחני של HDL פונקציה27,28.
הריבית האחרונות התמקדה ההשלכות פונקציונלי של חמצון ה-HDL, שהוא התוצאה של חמצון של שומנים וחלבונים בתוך ה-HDL 27,29,30. מחקרים קודמים הראו כי חמצון של HDL פוגע HDL פונקציה 27,29,30. HDL יש תפקיד מרכזי בהעברה חמצן השומנים, כמות גבוהה של שומנים בדם משתכים שטח ניקוי קשורה לתפקוד נורמלי של HDL. ובכך HDL השומנים חמצן תוכן שניתן להשתמש כדי לקבוע את ה-HDL פונקציה 9,17,20,31 ו נתן את המגבלות המוכרות של מבחני מוקדמת של HDL פונקציה7, 15,27,32, פיתחנו שיטה חלופית fluorometric זה מכמת HDL השומנים תוכן חמצן (HDLox) 32. שיטה זו מבוססת על peroxidase חזרת את האנזים (HRP) ו fluorochrome את אדום Amplex אשר יכולים לכמת (ללא כולסטרול אוקסידאז) את השומנים התוכן חמצן לכל מ”ג של ה-HDL-C 32. עקרון וזמינותו הביוכימי מוצג באיור1. אנחנו הראו כי גישה זו מבוססת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אין המגבלות של27,מבחני תפקוד HDL מוקדמת28. יש כבר מעודן, סטנדרטית במעבדה שלנו כך זה יכול לשמש באופן אמין במחקרים בבני אדם בקנה מידה גדול, אפילו עם פלזמה cryopreserved 32,33,34, עוד יותר assay הזה 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. readout assay זו מזוהה עם המפרט של המאומת מבוססת תא מבחני, הפונדקאית מדדים של מחלות לב וכלי דם, דלקת מערכתית, תפקוד המערכת החיסונית, סיכון קרדיו-וסקולריות ושל מטבולית המשויך פנוטיפים 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. כאן, אנו מתארים שיטה זו פשוטה, עדיין חזקים כדי למדוד את ה-HDL השומנים חמצן תוכן (HDLox). Assay הזה יכול לשמש ככלי לענות על שאלות מחקר חשוב לגבי התפקיד של פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות בו דלקת מערכתית, סטרס חמצוני ושומנים מחמצנים יש תפקיד מפתח (כגון טרשת עורקים)32.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מציע כלי חזקים כדי לענות על שאלות מחקר חשוב לגבי התפקיד של פונקציית ה-HDL טרשת עורקים, מחלות אנושיות. וזמינותו מכמת את ה-HDL השומנים התוכן חמצן לכל מ”ג של ה-HDL-C באמצעות הגברה אנזימטי (HRP). גישה זו מונע המגבלות המוכרות של מבחני תפקוד HDL מוקדמת (למשל וזמינותו בזרימת כולסטרול) כו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מאשר בתודה את העבודה של ד ר פרהיוט אבבה Navab, אלן פוגלמן Reddy סריניוואסה עבור שלהם תפקיד מפתח בפיתוח של חזרות קודמות של מודל זה. T.A.A. נתמך על ידי RMIT אוניברסיטת סגן-הנשיא של הבתר-דוקטורים. AJ AH נתמכים על ידי מענק פרוייקט NHMRC 1108792. TK נתמך על-ידי NIH מעניקה NIH K08AI08272, גרנט NIH/NCATS # µL1TR000124.
Materials
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387–955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
References
- Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein–the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
- Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
- Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
- Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, S145-S149 (2009).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
- Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
- Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
- Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
- Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
- Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
- Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
- Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
- Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
- Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
- Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
- Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
- Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
- Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
- Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
- Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
- Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
- Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
- Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
- Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
- Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
- Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL–an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
- Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
- Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
- Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
- Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
- Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
- Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
- Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
- Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
- Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
- Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
- Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
- Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
- Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
- Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
- von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
- de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
- Stocker, R., Keaney, J. F. Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
- Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
- Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
- Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
- Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
- Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
- Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
- Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
- Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van’t Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
- Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
- Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
- Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
- Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).
