高密度リポタンパク質の脂質過酸化反応の高スループット測定用無細胞生化学的蛍光酵素試金
Summary
HDL 脂質過酸化反応の定量の蛍光細胞生化学アッセイをご紹介します。この迅速かつ再現可能な測定は大規模な研究で HDL 機能を決定するため使用することができ、ヒトの疾患における HDL の機能の私達の理解に貢献することができます。
Abstract
低高比重リポ蛋白コレステロール (HDL-C) は、動脈硬化性心血管疾患 (CVD) の最も強力な独立した否定的な予測因子の 1 つです。HDL-C よりもむしろ HDL の機能と構造は、アテローム性動脈硬化をより正確に予測可能性があります。いくつか HDL タンパク質と脂質組成変化 HDL の機能を損なうことは、動脈硬化症などの炎症性の状態で発生します。HDL 関数通常標準化の多数の欠点不足しているコレステロール排出分析がこれらのアッセイなどの試金に基づくセルによって決定されます。細胞アッセイは、HDL の機能細胞に基づく試金と比較してより強固な対策を与える可能性があります。HDL の酸化は、HDL の機能を損ないます。HDL は、脂質過酸化物の輸送の主要な役割と過酸化脂質の高い金額は HDL の機能異常に関係。脂質プローブの相互作用は、脂質の酸化状態を測定するため試金非酵素的蛍光の結果を解釈するときに考慮されなければなりません。これは内容を査定する HDL 脂質過酸化物 (HDLox) HDL の機能不全に貢献する細胞生化学的酵素法を開発する動機。この手法は酵素西洋わさびの過酸化酵素 (HRP) と螢光色素 (コレステロールオキシダーゼ) なし HDL-C の mg 当たり脂質過酸化物含有量を定量化できます Amplex 赤ここでプロトコルは螢光色素試薬を用いた HDL 脂質過酸化反応の describedfor 決定です。実験条件の厳格な標準化によって試金の変動を削減できます。高い HDLox 値は HDL の抗酸化機能の減少と関連付けられています。このアッセイの読み出しは、心血管疾患、全身性炎症、免疫機能障害、リスク心血管疾患や代謝表現型のサロゲート対策検証セルベースのアッセイのリードアウトに関連付けられます。この技術的なアプローチは、人間の病気、全身性炎症、酸化ストレスおよび酸化脂質 (動脈硬化) などの重要な役割がある HDL 機能を評価する手法です。
Introduction
動脈硬化性心血管疾患 (CVD) は、死の世界1,2の主要な原因です。疫学的研究は、反比例動脈硬化1,2の開発のリスクに関連付けられている一般的に高密度リポタンパク質 (HDL) コレステロールの低レベルを示しています。いくつかの研究は、HDL1,2のため抗動脈硬化の役割をサポートする HDL 減衰開始とアテローム性動脈硬化の進行メカニズムは複雑な3,4です。このように、複雑な構造と絶対レベルではなく、HDL の機能にはアテローム性動脈硬化5,6,7,8より正確に予測可能性が示唆されています。いくつか HDL タンパク質と脂質組成変化 HDL の機能を損なうことは、動脈硬化症などの炎症性の状態で発生します。これらは i) 減らす、コレステロール排出潜在的な9ii) 抗炎症作用と増加 HDL プロ炎症性蛋白6、7iii) 減少抗酸化因子レベルと活動と Hdl を減少させます。低密度リポタンパク質 (LDLox)10および iv の酸化を抑制する能力) 脂質ヒドロペルオキシド コンテンツおよび酸化還元活性 (HDLox)9,11を増やします。HDL の pleotropic 機能 (コレステロールの排出、抗酸化機能) などを評価する堅牢な試金が HDL-HDL-C クリニックでの定量を補完します。
HDL の機能通常、セルベースの方法コレステロール排出アッセイ8,12,13,14等により評価されます。これらのメソッドには、使用される電池の種類、報告の読み出しの種類、標準化の欠如とトリグリセリド7,15の交絡影響に関して重要な不均一性を含む主要な限界があります。これらの欠点は、大規模臨床研究16の困難をもたらします。細胞アッセイは、HDL の機能細胞に基づく試金と比較してより強固な対策を与える可能性があります。コレステロールの排出は HDL の最も重要な機能の 1 つが、細胞に基づく試金によってのみ決定できます。プロテオミクス17,18,19,20,21,22,など23、HDL の機能を確認する他の方法 24と HDL 機能17,22,25のセルベースの単球走化性アッセイの標準化されていない大規模な人間の研究では使用できません。
HDL が重要な抗酸化抗動脈硬化効果5,6,7,8。HDL の抗酸化機能は、以前携帯無料蛍光アッセイ26で LDL の存在下で決定されています。HDL の抗酸化能をこれらの生化学蛍光メソッドその同僚26とアラン Fogelman モハマド Navab によって開発されました。HDL 機能17,18,19,20,21,22,23 を決定するのにこれらのメソッドを使用している多くの人間研究 ,24脂質 (HDL) ・脂質 (LDL) と脂質螢光相互作用はこれら携帯無料非酵素的生化学的アッセイ HDL 関数27,28の再現性を制限可能性があります。
最近の関心は、脂質および HDL 27,29,30内の蛋白質の酸化の結果である HDL 酸化の機能的な結果を重視しています。先行研究が示されている HDL の酸化 HDL 関数27,29,30を損ないます。HDL は、脂質過酸化物の輸送の主要な役割と過酸化脂質の高い金額は HDL の機能異常に関係。このように HDL 脂質過酸化物含有量を HDL 機能9,17,20,31を決定するために使用、HDL 関数7の前のアッセイの既知の制限を付与できます。 15,27,32, HDL 脂質過酸化物含有量 (HDLox) 32を定量化する代替蛍光法を開発しました。このメソッドは、酵素西洋わさびの過酸化酵素 (HRP) と螢光色素 (コレステロールオキシダーゼ) なしの HDL-C 32mg 当たり脂質過酸化物含有量を定量化できます Amplex 赤に基づいています。アッセイの生化学的原理を図 1に示します。私たちは、この蛍光ベースのアプローチに事前 HDL 機能試金27,28の制限がないことを示しています。この試金をさらに洗練され、凍結プラズマ32,33,34,とも大規模な人間の研究で確実に使えるように、当研究室で標準化35,36,37,38,39,40,41,42このアッセイの読み出しは心血管疾患、全身性炎症、免疫機能障害、心血管疾患や代謝リスク表現型のサロゲート対策検証セルベースのアッセイのリードアウトに関連付けられて。32,33,34,35,36,37,38,39します。 ここでは、HDL の脂質過酸化物含有量 (HDLox) を測定するこの単純な、まだ強力なメソッドについて述べる。この試金することができます、使用することツールとして人間の病気で HDL 機能の役割について重要な研究の質問に答えるため全身性炎症、酸化ストレスおよび酸化脂質32(動脈硬化) など重要な役割。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明したプロトコルでは、アテローム性動脈硬化およびひと疾患における HDL 機能の役割について重要な研究の質問に答えるための強力なツールを提供しています。アッセイは、酵素増幅 (HRP) を用いた HDL-C の mg 当たり HDL 脂質過酸化物含有量を定量化します。この方法は使用される電池の種類、報告の読み出しの種類、標準化の欠如と交絡効果に関して重要な不均一性を含む事前 HDL ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者は感謝してこのモデルの以前のイテレーションの開発の重要な役割の Dr モハマド Navab、アラン Fogelman、シュリニヴァーサ ・ レディの仕事を認めます。T.A.A. は、RMIT 大学副-一等書記官のポスドク研究員プログラムによってサポートされます。AJ と AH は、NHMRC プロジェクト助成金 1108792 でサポートされます。TK に支えられて NIH 助成金 NIH K08AI08272、NIH/NCATS グラント # µL1TR000124。
Materials
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387–955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
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