고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과
Summary
여기 HDL-지질 과산화의 결정에 대 한 fluorometric 셀 무료 생화학 분석 결과 설명합니다. 이 신속 하 고 재현성 분석 결과 대규모 연구에서 HDL 함수를 확인 하는 데 사용 수 고 인간의 질병에 HDL 함수에 대 한 우리의 이해에 기여할 수 있다.
Abstract
낮은 고밀도 지 단백 콜레스테롤 (HDL-콜레스테롤) 수치는 동맥 경 화성 심혈 관 질환 (CVD)의 가장 강력한 독립적인 부정적인 예측 중 하나입니다. 구조와 기능 보다는 HDL-콜레스테롤 HDL의 동맥 경화를 예측 더 정확 하 게 수 있습니다. 몇 가지 HDL 단백질과 지질 구성 변경 사항을 HDL 기능 손상 동맥 경화 증 같은 염증 성 상태에 발생 합니다. HDL 함수 일반적으로 콜레스테롤 경과 분석 결과 이러한 분석 등 분석은 표준화의 수많은 단점 부족 세포 기반으로 의해 결정 됩니다. 셀 무료 분석 실험 세포 기반 분석 실험에 비해 HDL 함수의 보다 강력한 대책을 줄 수 있습니다. HDL 산화 HDL 기능을 손상 한다. HDL 지질 과산화 수소 수송에 있는 중요 한 역할 및 지질 과산화물의 높은 금액은 비정상적인 HDL 함수 관련. 지질 조사 상호 작용은 지질 산화 상태를 측정 하기 위한 분석 실험 비 효소 형광의 결과 해석 할 때 고려 되어야 한다. 이 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDLox) HDL 역 기능에 기여를 평가 하기 위해 셀 무료 생화학 효소 방법 개발 동기. 이 방법은 효소 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 및 HDL-C의 밀리 그램 당 지질 과산화 수소 콘텐츠 (없이 콜레스테롤 산화 효소) 계량 수 Amplex 레드 형광 색소에 따라 여기는 프로토콜은 형광 색소 시 약을 사용 하 여 HDL-지질 과산화의 describedfor 결정. 분석 결과 변화 실험 조건의 엄격한 표준화에 의해 줄일 수 있습니다. HDLox 값이 높을수록 감소 된 HDL 항 산화 기능으로 연결 됩니다. 이 분석 결과의 판독은 유효한 세포 기반 분석, 심혈 관 질환, 조직의 염증, 면역 부전, 및 관련된 심혈 관 및 대사 위험 고기 대리 측정의 판독에 연관 된다. 이 기술적인 접근 조직의 염증, 산화 스트레스와 산화 지질 (동맥 경화) 등 중요 한 역할을가지고 인간의 질병에 HDL 기능을 평가 하는 강력한 방법입니다.
Introduction
동맥 경 화성 심혈 관 질환 (CVD) 죽음 전세계1,2의 주요 원인입니다. 역학 연구 고밀도 지단백 (HDL) 콜레스테롤의 저급은 반대로 동맥 경화1,2의 개발에 대 한 위험과 연관 일반적으로 나타났습니다. 여러 연구는 HDL1,2atheroprotective 역할을 지원, 비록는 HDL 약하게 시작 및 동맥 경화의 진행 하는 메커니즘은 3,4입니다. 따라서, 그것은 복잡 한 구조와 기능 절대 수준 보다는 오히려 HDL의 아 테 롬 5,6,,78예측 더 정확 하 게 수 있습니다 제안 되었습니다. 몇 가지 HDL 단백질과 지질 구성 변경 사항을 HDL 기능 손상 동맥 경화 증 같은 염증 성 상태에 발생 합니다. 이러한 i) 감소는 콜레스테롤 경과 잠재적인 9, ii) 항 염증 및 증가 HDL 관련 된 프로-염증 성 단백질 6,7, iii) 감소 항 산화 요소 수준 및 활동 및 HDLs 감소 낮은 밀도 지 단 백 질 (LDLox)10 및 4의 산화를 억제 하는 기능) 지질 hydroperoxide 콘텐츠 및 산화 환 원 활동 (HDLox)9,11증가. 수 있습니다 (예: 콜레스테롤 경과, 항 산화 기능) HDL의 pleotropic 기능을 평가 하는 강력한 분석 HDL-HDL-콜레스테롤은 병원에서의 보완 하는 것입니다.
HDL 함수는 일반적으로 콜레스테롤 경과 분석 결과8,12,,1314같은 셀 기반 방법으로 평가 됩니다. 이러한 방법을 사용 하는 세포의 종류, 유형의 판독 보고, 표준화의 부족 및 트리 글리세라이드 7,15의 혼란 효과 관해서 중요 한이 포함 한 주요 제한이. 이러한 단점이 큰 임상 연구16어려움 포즈. 셀 무료 분석 실험 세포 기반 분석 실험에 비해 HDL 함수의 보다 강력한 대책을 줄 수 있습니다. 콜레스테롤 경과 HDL의 가장 중요 한 기능 중 하나 이지만 그것은 세포 기반 분석 실험에 의해 결정 수 있습니다. Proteomics17,18,19,20,,2122,23, 같은 HDL 함수를 확인 하는 다른 접근 24 및 HDL 함수 17,,2225 의 셀 기반 monocyte chemotaxis 분석 실험 표준화 되지 대규모 인간 연구에 사용할 수 없습니다.
HDL는 중요 한 항 산화 atheroprotective 효과5,6,,78. HDL의 항 산화 기능 이전 셀 무료 fluorometric 분석 실험 26에 LDL의 존재 결정 했다. 이러한 생화학 fluorometric 방식의 HDL 항 산화 기능 모하마드 Navab과 앨런 Fogelman26그들의 동료 의해 원래 개발 되었다. 비록 많은 인간 연구 HDL 함수 17,18,19,20,,2122,23 결정 하기 위해 이러한 방법을 사용 ,24, 지질 (HDL)-지질 (LDL) 및 지질-형광 색소 상호 작용의 이러한 셀 무료 비 효소 생 화 확 적인 분석 실험 HDL 기능27,28의 재현성을 제한할 수 있습니다.
최근 관심은 지질과 HDL 27,,2930단백질의 산화 결과 HDL 산화의 기능적 결과에 집중 했다. 사전 연구 HDL의 그 산화 손상 HDL 기능 27,,2930. HDL 지질 과산화 수소 수송에 있는 중요 한 역할 및 지질 과산화물의 높은 금액은 비정상적인 HDL 함수 관련. 따라서 HDL 지질 과산화 수소 수 수 HDL 함수 9,17,,2031 을 결정 하는 데 사용 내용과 주어진 HDL 기능7의 이전 분석 실험의 알려진된 제한 사항 15,,2732, 우리 개발 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDLox) 32단정 대체 fluorometric 메서드입니다. 이 방법은 효소 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 및 HDL-C 32의 mg 당 지질 과산화 수소 콘텐츠 (없이 콜레스테롤 산화 효소) 계량 수 Amplex 레드 형광 색소를 기반으로 합니다. 분석 결과의 생 화 확 적인 원리는 그림 1에 표시 됩니다. 우리는이 형광 기반 접근 이전 HDL 기능 분석 실험27,28의 한계는 없습니다 나타났습니다. 이 분석 결과 더 세련 되 고도 cryopreserved 플라즈마 32,,3334, 와 함께 대규모 인간 연구에서 안정적으로 사용할 수 있도록 우리의 실험실에서 표준화 되어 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42.이 분석 결과의 판독은 판독 검증된 세포 기반 분석, 심혈 관 질환, 조직 염증, 면역 부전 및 관련된 심혈 관 및 대사 위험 고기 대리 조치의 연관 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. 여기, 우리이 간단 하면서도 강력한 방법을 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 (HDLox)를 측정 하는 설명. 이 분석 결과 사용할 수 있습니다 도구 HDL 함수 인간의 질병에서의 역할에 관한 중요 한 연구 질문에 대답 하 조직의 염증, 산화 스트레스와 산화 지질32(동맥 경화) 등 중요 한 역할가지고.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜 동맥 경화 및 인간 질병에 HDL 함수의 역할에 관한 중요 한 연구 질문에 대답 하는 강력한 도구를 제공 합니다. 분석 결과 효소 증폭 (HRP)를 사용 하 여 HDL-콜레스테롤의 mg 당 HDL 지질 과산화 수소 콘텐츠 단정. 이 접근 방지 사용 하는 세포의 종류, 유형의 판독 보고, 표준화의 부족과 혼란 효과 관해서 중요 한이 포함 하 여 이전 HDL 기능 분석 (예: 콜레스테롤 경과 분석 결과…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기꺼이이 모델의 이전 반복의 개발에 그들의 중요 한 역할에 대 한 박사 모하마드 Navab, 앨런 Fogelman와 스리 니 바사 레디의 작품을 인정합니다. T.A.A.는 RMIT 대학 담당-장관의 박사 장학금에 의해 지원 됩니다. AJ와 아 NHMRC 프로젝트 그랜트 1108792에 의해 지원 됩니다. TK에 의해 지원 됩니다 NIH 부여 NIH K08AI08272, NIH/NCATS 그랜트 # µL1TR000124.
Materials
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387–955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
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