Ячейки бесплатно биохимических флуориметрический ферментативные Assay высок объём измерения перекисного окисления липидов в липопротеинов высокой плотности
Summary
Здесь мы описываем флуориметрический свободных клеток биохимических assay для определения HDL-перекисного окисления липидов. Этот быстрый и воспроизводимые assay может использоваться для определения функции HDL в крупных исследований масштаба и может способствовать нашему пониманию функции HDL заболеваний человека.
Abstract
Холестерина низкой липопротеинов высокой плотности (HDL-C) являются одним из самых мощных независимых негативные предикторы атеросклеротической сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Структура и функции ЛПВП, вместо того, чтобы HDL-C может более точно предсказать атеросклероза. Несколько HDL белков и липидов композиционные которые ухудшить HDL функции происходят изменения в воспалительных заболеваниях, таких как атеросклероз. HDL функция определяется обычно ячейки на основе анализов, таких как холестерин измеряем пробирного но эти анализы имеют многочисленные недостатки отсутствием стандартизации. Ячейки бесплатные анализы могут дать более надежные меры HDL функции по сравнению с анализов на основе ячеек. HDL окисления повреждает функцию HDL. HDL имеет главную роль в липидной перекиси транспорта и высокое количество перекисей липидов связано с ненормальной функции HDL. Липидов зонд взаимодействия следует рассматривать при интерпретации результатов неферментативного флуоресценции assays для измерения окислительное состояние липидов. Это побудило нас к разработке свободных клеток биохимических ферментативного метода для оценки HDL перекиси содержание липидов (HDLox), способствующий HDL дисфункции. Этот метод основан на фермента пероксидазы (ПХ) и флюрохром красный Amplex, которые могут количественно охарактеризовать (без холестерина оксидаза) перекиси содержание липидов на мг HDL-C. Вот протокол describedfor определение HDL-перекисного окисления с помощью флюрохром реагента. Пробирного изменчивость может быть уменьшена строгой стандартизации экспериментальных условиях. Более высокие значения HDLox связаны с снижение HDL антиоксидантные функции. Индикация этот assay связан с отсчетов проверенных анализов на основе ячеек, суррогатных мер сердечно-сосудистых заболеваний, внутрирастительного воспаления, иммунной дисфункции и связанного с ними риска сердечно-сосудистой и метаболической фенотипов. Этот технический подход является надежный метод оценки функции HDL в человеческих заболеваний, где внутрирастительного воспаления, оксидативный стресс и окисленных липидов играют ключевую роль (например, атеросклероз).
Introduction
Атеросклеротические сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) является ведущей причиной смерти во всем мире1,2. Эпидемиологические исследования показали, что низкие уровни холестерина липопротеинов высокой плотности (HDL), как правило, обратно, связанные с риском развития атеросклероза1,2. Хотя некоторые исследования поддерживают atheroprotective роль для ЛПВП1,2, механизм, по которому HDL ослабляет посвящения и прогрессирования атеросклероза является комплекс 3,4. Таким образом было высказано предположение о том, что сложная структура и функции ЛПВП, а не абсолютный уровень может более точно предсказать атеросклероза 5,6,,78. Несколько HDL белков и липидов композиционные которые ухудшить HDL функции происходят изменения в воспалительных заболеваниях, таких как атеросклероз. Эти i) сократить ее уровень холестерина измеряем потенциальных 9, ii) уменьшить противовоспалительный и повышение ЛПВП связанные pro воспалительные белки 6,7, iii) снижение антиоксидантной фактор уровней и деятельности и HDL способностью ингибировать окисления липопротеидов низкой плотности (LDLox)10 и iv) увеличить липидов гидропероксид содержание и окислительно-восстановительной деятельности (HDLox)9,11. Надежные анализы, которые оценивают pleotropic функции HDL (например холестерин измеряем, Антиоксидантная функция) может дополнить определение HDL-HDL-C в клинике.
HDL функция обычно оценивается на основе ячеек методами, такими как холестерин измеряем пробирного8,12,,1314. Эти методы имеют основные ограничения, включая значительную гетерогенность в отношении типов клеток используется, тип индикации сообщили, отсутствие стандартизации и накладывающееся воздействие триглицеридов 7,15. Эти недостатки представляют трудности для крупных клинических исследований16. Ячейки бесплатные анализы могут дать более надежные меры HDL функции по сравнению с анализов на основе ячеек. Измеряем холестерина является одним из наиболее важных функций ЛПВП, но он только может определяться на основе ячеек анализов. Другие подходы для определения HDL функции, такие как протеомики17,18,19,20,21,,2223, 24 и хемотаксис анализов на основе ячеек Моноцит HDL функция 17,,2225 не были стандартизированы и не может использоваться в крупных масштабах человеческих исследований.
HDL имеет значительные антиоксидантными atheroprotective эффект5,6,,78. Антиоксидантная функция HDL определил присутствии ЛПНП в предыдущей ячейке бесплатно флуориметрический анализов 26. Эти биохимические методы флуориметрический HDL антиоксидантные функции были первоначально разработан Мохамад Наваб и Алан Фогельман и их коллег26. Хотя многие человеческие исследования использовали эти методы для определения HDL функция 17,18,19,20,21,22,23 ,24, липидов (HDL)-липидов (ЛПНП) и липидов флюрохром взаимодействия может ограничить воспроизводимость этих клеток бесплатно неферментативного биохимических анализов HDL функция27,28.
Последнее время интерес была сосредоточена на функциональных последствий HDL окисления, что является результатом окисления липидов и белков в пределах HDL 27,29,30. Предыдущие исследования показали, что окисление HDL ухудшает HDL функция 27,29,30. HDL имеет главную роль в липидной перекиси транспорта и высокое количество перекисей липидов связано с ненормальной функции HDL. Таким образом могут быть использованы для определения HDL функция 9,17,,2031 и учитывая известные ограничения предыдущих анализов HDL функция7, HDL липидной перекиси содержание 15,27,32, мы развитых флуориметрический альтернативный метод, который дает количественную оценку HDL липидной перекиси содержание (HDLox) 32. Этот метод основан на фермента пероксидазы (ПХ) и флюрохром красный Amplex, которые могут количественно охарактеризовать (без холестерина оксидаза) перекиси содержание липидов на мг HDL-C- 32. Биохимический принцип анализа показано на рисунке 1. Мы показали, что этот подход на основе флуоресценции не имеют ограничений предварительного HDL функция анализов27,28. Этот assay далее уточнены и стандартизированы в нашей лаборатории, так, чтобы он надежно может использоваться в крупных масштабах человеческой исследований, даже с криоконсервированных плазменный 32,33,34, 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. Индикация этот assay ассоциируется с отсчетов проверенных анализов на основе ячеек, суррогатных мер сердечно-сосудистых заболеваний, внутрирастительного воспаления, иммунной дисфункции и связанного с ними риска сердечно-сосудистой и метаболической фенотипов 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. здесь мы опишем этот простой, но надежный метод для измерения HDL липидной перекиси содержания (HDLox). Этот assay может использоваться как инструмент, ответить на вопросы важных исследований относительно роли функции HDL заболеваний человека где внутрирастительного воспаления, оксидативный стресс и окисленных липидов имеют ключевую роль (например, атеросклероз)32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанные здесь предлагает надежный инструмент ответить вопросы важных исследований относительно роли функции HDL в атеросклероза и заболеваний человека. Assay количественно перекиси содержание ЛПВП липидов на мг HDL-C помощью ферментационная амплификация (ПХ). Этот подход позво…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы с благодарностью отмечаем работу Наваб Мохамад доктор, Алан Фогельман и Редди Сриниваса за их ключевую роль в развитии более ранних итераций этой модели. T.A.A. поддерживается КМТИ университета вице-канцлера докторантура стипендий. AJ и AH поддерживаются NHMRC Грант проекта 1108792. TK поддерживается NIH предоставляет низ K08AI08272, гранта NIH/NCATS # µL1TR000124.
Materials
| Experimental Reagents | |||
| HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent | Pointe Scientific | H7511 | |
| Amplex Red reagent. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| DMSO. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Horse Radish Peroxidase (HRP) | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Esterase. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Cholesterol Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| Resorufin fluorescense Reference standard | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| 5x Reaction Buffer. | Life Technologies, Grand Island, NY | A12216 | Amplex Red Cholesterol Assay Kit. • ≤–20°C • Desiccate • Protect from light |
| HDL Cholesterol Automated Reagent | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | TR39601 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). | Sigma Aldrich | M0687 | |
| 96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). | Sigma Aldrich | M9936 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| ClipTip 200, sterile | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-488-058 | |
| Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125 | ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. | 14-387–955 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Gen5 2.01 software | Biotek, Vermont, USA | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Gen5 Plate reader | Biotek, Vermont, USA | NA |
References
- Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein–the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
- Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
- Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
- Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, S145-S149 (2009).
- Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
- Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
- Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
- Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
- Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
- Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
- Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
- Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
- Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
- Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
- Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
- Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
- Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
- Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
- Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
- Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
- Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
- Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
- Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
- Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
- Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
- Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL–an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
- Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
- Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
- Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
- Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
- Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
- Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
- Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
- Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
- Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
- Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
- Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
- Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
- Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
- Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
- von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
- de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
- Stocker, R., Keaney, J. F. Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
- Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
- Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
- Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
- Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
- Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
- Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
- Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
- Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van’t Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
- Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
- Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
- Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
- Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).
