تطبيق القرار فائقة السرعة سرعة الفحص المجهري في هدب الأولية الحية
Summary
مؤخرا نحن تعيين المواقع المكانية (3D) ثلاثي الأبعاد من طرق النقل لمختلف البروتينات ترانسلوكاتينج داخل أهداب الأساسية في الخلايا الحية. هنا تعيش هذه الورقة تفاصيل تطبيق الإعداد التجريبية والعملية للعينات البيولوجية وتحليل البيانات للأسفار 3D القرار العظمى التصوير نهجاً حديثا في أهداب الأولية.
Abstract
هدب الأولية المستندة إلى microtubule نتوء على السطح من العديد من الخلايا حقيقية النواة ويحتوي على مجموعة فريدة من نوعها من البروتينات التي تعمل حاسمة في حركية الخلية وإشارات. منذ أهداب قادرين على توليف البروتين الخاصة بهم، ما يقرب من 200 من البروتينات الهدبية فريدة من نوعها تحتاج إلى الاتجار بين سيتوسول واهداب الأولية. ومع ذلك، لا يزال تحديا تقنيا لتعيين مواقع (3D) ثلاثي الأبعاد لمسارات النقل لهذه البروتينات في أهداب الابتدائي حية بسبب القيود الموجودة حاليا تقنيات. للتغلب على هذا التحدي، مؤخرا لدينا المتقدمة والعاملين الفحص المجهري عالية السرعة قرار فائقة 3D ظاهري، تسمى نقطة واحدة الحافة–الإثارة مجهرية حيود الفرعية (سرعة)، تحديد الموقع المكاني ثلاثي الأبعاد لمسارات النقل كل سيتوسوليك وبروتينات الغشاء بأهداب الأولية للخلايا الحية. في هذه المقالة، سوف نظهر الإعداد التفصيلية لسرعة الفحص المجهري، إعداد الخلايا معربا عن الأسفار-البروتين المسمى البروتينات الهدبية وتتبع جزيء واحد في الوقت الحقيقي من البروتينات الفردية في هدب العيش وتحقيق خرائط ثلاثية الأبعاد المكانية الكثافة الاحتمالية لطرق النقل للبروتينات الهدبية.
Introduction
حيث ذكر إرنست [آب] في 1873، القرار للفحص المجهري الخفيفة التقليدية قد تم ويعتقد أن تقتصر على حوالي 200 شمال البحر الأبيض المتوسط بسبب حيود الضوء من الهدف1،2. حاليا تقنيات الفحص المجهري الخفيفة فائقة القرار كسر هذا القيد والسماح بالتقاط الصور الديناميكية مع القرار حيود الفرعية (< 200 nm). التقنيات عموما تندرج في فئتين عريضتين: حفز الانبعاثات استنفاد (STED) مجهرية على أساس النهج التي تولد حجم الإضاءة الحيود الفرعية بسبب الاستجابة البصرية غير الخطية من فلوروفوريس في3من العينات؛ ومن فوتواكتيفاتيد الخفيفة الميكروسكوب (النخيل) والتعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)-على أساس تقنيات فائقة القرار، التي تستخدم الدوال الرياضية تعريب سينترويدس فلوروفوريس وثم إعادة تشكيل هذه سينترويدس لنموذج القرار فائقة الصور4،5. حاليا، بسبب الإعداد الضوئية غير معقدة نسبيا، النخيل والعاصفة على نطاق واسع يعملون بتفعيل فقط مجموعة فرعية صغيرة من فلوروفوريس في كل إطار من شريط فيديو طويل لتحضير البيولوجية. وهذا يسمح للترجمة أكثر دقة بملائمة غاوسي 2D من بقعة مضيئة، يسمى الدالة نقطة انتشار (PSF)، البروتينات المسماة فلوريسسينتلي في كل إطار من الفيديو. ثم يمكن تركيب موقع 2D كل جزيء المسمى فلوريسسينتلي على متن طائرة تصوير واحد لإنتاج صورة فائقة قرار لإعداد البيولوجية1،2. بينما هذه الترجمة جزيء واحد، نهج القرار فائقة للفحص المجهري ثورة التأكيد كيف أنجز تصوير العينات البيولوجية، ولا تزال هناك تحديات يجب التغلب عليها. على سبيل المثال، العاصفة والنخيل يمكن تحقيق أفضل الحلول المكانية الخاصة بها بعد تثبيت العينات البيولوجية وهكذا يقدم تمثيل ثابت للبروتينات المسمى فلوريسسينتلي، ووجود قيود مماثلة على الميكروسكوب الإلكتروني. بالإضافة إلى ذلك، تحقيق عالية الدقة المكانية لكل البروتين المسمى فلوريسسينتلي في الخلايا الحية، يجب تصويرها عينات في فراميراتس طويلة جداً وغير قادر على التقاط ديناميات البروتين. ولذلك، من الضروري للتغلب على هذه العقبات التقنية الرئيسية.
للحصول على دقة عالية الزمانية المكانية التي مناسبة تماما لكشف البروتينات أو الكشف تتحرك بسرعة في الخلايا الحية، وقد وضعنا القرار فائقة السرعة مجهرية في لدينا مختبر (الشكل 1)6،7، 8-عدة أوجه التقدم التقني الرئيسية في سرعة الفحص المجهري مكنتنا سابقا لتعقب النقل نوكليوسيتوبلاسميك من الجزيئات الصغيرة بنجاح، والبروتينات، ومرناً والفيروسات من خلال الأم النووية المسام المجمعات (الشخصيات)6، 7 , 8-بإيجاز، سيتم استخدام الميزات التالية لسرعة الفحص المجهري لتعقب الجزيئات تتحرك بسرعة من خلال الهياكل الفرعية ميكرومتر التناوب متناظرة في الخلايا الحية، مثل الشخصيات واهداب الأولية: (1) يميل أو الإضاءة الرأسية PSF تمكن إثارة جزيئات مفردة داخل وحدة تخزين صغيرة حيود حد في المستوى البؤري (الشكل 1)؛ (2) PSF يميل يمكن تجنب الأسفار خارج نطاق التركيز إلى حد كبير ومن ثم تحسين نسبة الإشارة إلى الضجيج. (3) كثافة بصرية من 100-500 كيلو واط/سم2 في الإضاءة PSF يسمح آلاف فوتونات التي سيتم جمعها من فلوروفوريس واحدة مع الكشف بسرعة بسرعة (> 500 هرتز). (4) الصيام الكشف عن سرعة يقلل إلى حد كبير أيضا خطأ التعريب المكانية جزيء مفرد (< 10 نانومتر) في تحديد مسارات المكانية تتحرك الجزيئات الفلورسنت في الخلايا الحية، نظراً للانتشار الجزيئي أحد العوامل الرئيسية تسبب عيوب التعريب جزيء واحد لنقل الجزيئات. (5) الراسخة في 2D إلى 3D التحويل خوارزميات تمكننا من توفير خرائط ثلاثية الأبعاد المكانية الكثافة الاحتمالية لطرق النقل للجزيئات في المجلس الوطني أو هدب الأولية. الجدير بالذكر أن لدينا عملية التحويل بين ديكارت ونظام التنسيق أسطواني يستخدم لتوليد كثافة الاحتمالية مكانية 3D خريطة بدلاً من 3D جزيء واحد تعقب (الشكل 2). سابقا، قد كشفت البيانات الميكروسكوب الإلكتروني أن9،المجلس الوطني10 و هدب الابتدائية11 كلا من بنية متناظرة التناوب. من حيث المبدأ، ينبغي نشرها الجزيئات تتحرك من خلال المجلس الوطني للصحافة أو هدب الأولية عشوائياً أيضا أن التوزيعات التناوب متناظرة. كما هو مبين في الشكل 2، عدد كبير من نشرها الجزيئات داخل الاسطوانة عشوائياً من شأنه أن يولد توزيعات التناوب متناظرة في عرض المقطع العرضي كالتي في المجلس الوطني، كما أدى نحو موحد المكانية التوزيع داخل كل منطقة فرعية صغيرة جداً بين اثنين من حلقات المجاورة (الشكل 2ه). ويؤدي هذا التوزيع الموحد أن التوزيع المكاني على طول البعد θ في نظام أسطواني ثابت. ثم يمكن تبسيط إحداثيات ثلاثي الأبعاد (R, X, θ) أن تكون إحداثيات 2D (R, X, ثابت). في الواقع، لدينا عملية التحويل بين نظامي أسطواني وديكارت من 2D (X, Y) 2D (R, X, ثابت). Θ ثابتة، تشير إلى الكثافة المكانية ف في الشكل 2ه، ويتم حسابها باستخدام المعادلة A
.
وفي نهاية المطاف، تتبع جزيء واحد له تطبيق واسع في البحوث البيولوجية، ومن ثم، فمن الطبيعي أن توضع مجموعة كبيرة تقنيات لسد منافذ البيولوجية المحددة12،،من1314. وهذا هو الحال بالنسبة لسرعة الفحص المجهري. سابقا، عندما يقترن مع خوارزمية تحول 3D، تم تطوير هذا الأسلوب لحل طرق النقل 3D لعبور الجزيئات من خلال اللجان التحضيرية الوطنية، هيكل البيولوجي التناوب متماثل والحجم diffraction الفرعية6. في هذه الورقة، تظهر أهداب الأولية لتكون نموذجا ممتازا العضيات كذلك. أهداب الأولية هي العضيات أسطواني، مثل هوائي (radius نانومتر ~ 125) أن المشروع من على سطح الأرض من الثدييات معظم الخلايا15،16،17. فمسؤولة عن تلقي إشارات خارجية، ويحيل بها استجابة داخل الخلايا المرتبطة عادة بالنمو والايض15،16. ولذلك، تدفق البروتينات الهيكلية، إعادة تدوير مستقبلات transmembrane، وانتقال الرسل داخل الخلايا المسؤوليات الحيوية من أهداب الأولية. في هذا المنعطف بين أهداب الابتدائي وجسم الخلية هو حاجز انتقائية حرجة، تسمى منطقة انتقالية أو TZ، من خلاله يجب أن يحدث كل هذا النقل البروتين11،،من1819، 20. بالإضافة إلى وظيفة TZ النابضة، واثنين على الأقل من عمليات النقل، النقل إينترافلاجيلار ونشر السلبي، يعتقد أن تكون مسؤولة عن حركة البروتين من خلال هذه المنطقة16،21، 22-من وجهة نظر صحة بشرية، فقدان أهداب الابتدائي وإلغاء الضوابط التنظيمية اللاحقة مما يشير إلى المصب مميزة لكثير من أنواع السرطان. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الأمراض الوراثية مثل متلازمة باردت-بيدل ومرض تكيس الكلي، ترتبط بالبروتين معيبة النقل23. جعل حجم الحد حيود الفرعية والعملية المعقدة للنقل البروتين انتقائية عن طريق TZ أهداب الابتدائي هدفا رئيسيا لهذه التقنية. في هذه الورقة، والأساليب وسوف نظهر تتبع البروتين transmembrane الهدبية، مستقبلات سوماتوستاتين 3 (SSTR3)24، المسمى خارجياً مع أليكسا فلور 647 ومكون من ايفت، IFT2025، المسمى مع جزيء تنصهر في التجارة والنقل.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول تطبيق سرعة الفحص المجهري هدب الأولية، عضية إشارات خلوية التي عالية تعتمد على البروتين كفاءة النقل. سرعة الفحص المجهري يمكن أن توفر دقة عالية مواقع (< 10 نانومتر) للجزيئات المسماة فلوريسسينتلي كما أنها تمر عبر الإضاءة نقطة واحدة تركز على TZ. سابقا قد طبق على دراسة البروتين…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور كريستين فرهي (جامعة ميتشيغان، أن أربور) والدكتور غريغوري بازور (كلية الطب في جامعة ماساتشوستس) لتوفير بعض والبلازميدات. وأيد المشروع المنح المقدمة من “المعاهد الوطنية للصحة” (المعاهد الوطنية للصحة GM097037 و GM116204 و GM122552 إلى W.Y.).
Materials
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25×36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).
- Leung, B. O., Chou, K. C. Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology. Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Meth. 3, 793-796 (2006).
- Ma, J., Yang, W. Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).
- Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).
- Ma, J., et al. High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore. Nat Comm. 4, (2013).
- Akey, C. W., Radermacher, M. Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).
- Akey, C. W. Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy. J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).
- Czarnecki, P. G., Shah, J. V. The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine. Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).
- Elf, J., Li, G. -. W., Xie, X. S. Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell. Science. 316, 1191-1194 (2007).
- Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. 3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles. J Vis Exp. , (2014).
- Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue. PloS one. 5, 11639 (2010).
- Marshall, W. F., Nonaka, S. Cilia: tuning in to the cell’s antenna. Curr Biol. 16, 604-614 (2006).
- Scholey, J. M., Anderson, K. V. Intraflagellar transport and cilium-based signaling. Cell. 125, 439-442 (2006).
- Yang, T. T., et al. Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone. Sci Rep. 5, 14096 (2015).
- Craige, B., et al. CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content. J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).
- Kee, H. L., et al. A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia. Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).
- Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).
- Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).
- Ye, F., et al. Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors. Elife. 2, 00654 (2013).
- Ross, A. J., et al. Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates. Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).
- Handel, M., et al. Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia. Neuroscience. 89, 909-926 (1999).
- Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly. Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).
- Awata, J., et al. NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone. J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).
- Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
