Anwendung des High-Speed-Höchstauflösung Geschwindigkeit Mikroskopie in Live primäre Zilie
Summary
Vor kurzem abgebildet wir die dreidimensionale (3D) räumlichen Positionen der Transportwege für verschiedene Proteine in primäre Zilien in lebenden Zellen translocating. Hier leben diese Papier-Details, die in der Versuchsanordnung, den Prozess der biologischen Proben und der Datenanalyse für die 3D Höchstauflösung Fluoreszenz imaging Ansatz neu angewendet primäre Zilien.
Abstract
Die primäre Zilie ist eine Vorwölbung Mikrotubuli-basierte auf der Oberfläche vieler eukaryotischer Zellen und enthält einer einzigartige Ergänzung der Proteine diese Funktion kritisch in Zelle Motilität und Signalisierung. Da Zilien nicht in der Lage eigene Protein zu synthetisieren sind, müssen fast 200 einzigartige ciliary Proteine zwischen dem Cytosol und primäre Zilien verschleppt werden. Es ist jedoch immer noch eine technische Herausforderung für dreidimensionale (3D) Standorte der Transportwege für diese Proteine in live primäre Zilien aufgrund der Einschränkungen der derzeit bestehenden Karte Techniken. Um die Herausforderung zu erobern, haben vor kurzem wir entwickelt und beschäftigt eine High-Speed-virtuelle 3D Höchstauflösung Mikroskopie, Einpunkt-Kante-Erregung Sub Beugung (Geschwindigkeit) Mikroskopie, um festzustellen, die 3D räumliche Lage der Transportwege für bezeichnet Beide cytosolischen und Membranproteine in primäre Zilien von lebenden Zellen. In diesem Artikel zeigen wir die detaillierte Setup SPEED-Mikroskopie, die Vorbereitung der Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-Protein-Label ciliary Proteine, die Echtzeitverfolgung der Einzelmolekül-einzelne Proteine in live Zilie und die Erreichung Karten 3D räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte der Transportwege für ciliary Proteine.
Introduction
Da Ernst Abbe im Jahre 1873 erklärte, hat die Auflösung der konventionellen Lichtmikroskopie angenommen wurde, beschränkt sich auf etwa 200 nm durch Lichtbeugung aus dem Ziel1,2. Derzeit Höchstauflösung lichtmikroskopische Techniken brechen diese Einschränkung und ermöglicht die Erfassung von dynamischen Bildern mit Sub-Beugung (< 200 nm) Auflösung. Die Techniken in der Regel fallen in zwei Hauptkategorien: stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie-basierte Ansätze, die Sub-Beugung Beleuchtung Volumen durch nichtlineare optische Reaktion des Fluorophore Proben3; generieren und photoaktiviert Lichtmikroskopie (PALM) und stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (STORM)-basierte Höchstauflösung Techniken, die mathematische Funktionen zum Zentroiden des Fluorophore lokalisieren und dann rekonstruieren diese Zentroide nutzen Super-Resolution Bilder4,5zu bilden. Derzeit sind aufgrund der relativ unkomplizierten optische Aufbau PALM und Sturm ausgiebig beschäftigt durch die Aktivierung nur einer kleinen Teilmenge der Fluorophore in jedem Frame ein langes Video eines biologischen Präparates. Dies ermöglicht genauere Lokalisierung von 2D “glockenförmig” Einbau von fluoreszierenden Ort bezeichnet die Point-spread-Funktion (PSF), Fluoreszent-markierten Proteine in jedem Frame des Videos. Die 2D Position jedes Molekül Eindringmittel beschriftet kann dann auf einen einzigen Abbildungsebene Höchstauflösung Bilder des biologischen Vorbereitung1,2überlagert werden. Während diese Lokalisierung Einzelmolekül-Höchstauflösung Ansätze zur Mikroskopie sicherlich revolutioniert wie Bildgebung von biologischen Proben durchgeführt wurde, gibt es noch Herausforderungen zu bewältigen. Beispielsweise können Sturm und PALM erreichen ihre beste räumlicher Auflösung nach der Fixierung von biologischen Proben und so präsentieren eine statische Darstellung der Fluoreszent-markierten Proteine, die eine ähnliche Einschränkung der Elektronenmikroskopie. Darüber hinaus müssen die Erreichung hohen räumlichen Auflösung für jedes Fluoreszent-markierten Protein in lebenden Zellen, Proben bei sehr langen Frameraten abgebildet werden die Proteindynamik erfassen können. Daher ist es notwendig, diese wichtigsten technische Hürden zu überwinden.
Um eine hohe räumlich-zeitliche Auflösung zu erhalten, die gut geeignet für die Erkennung von schnelllebigen Proteine oder RNA in lebenden Zellen ist, entwickelten wir Höchstauflösung Geschwindigkeit Mikroskopie in unserem Labor (Abbildung 1)6,7, 8. mehrere große technische Fortschritte in der Geschwindigkeit Mikroskopie haben zuvor konnten wir erfolgreich Nucleocytoplasmic Transport von kleinen Molekülen verfolgen, Proteine, mRNA und Virus durch Native nuclear pore komplexe (NPCs)6, 7 , 8. kurz, die folgenden Merkmale des SPEED-Mikroskopie werden zur schnelllebigen Makromoleküle durch Sub-Mikrometer rotationssymmetrisch Strukturen in lebenden Zellen, wie NPCs und primäre Zilien verfolgen: (1) eine geneigte oder eine vertikale Beleuchtung PSF ermöglicht die Anregung von einzelnen Molekülen in einem kleinen Beugungsgrenze Volumen in der Brennebene (Abbildung 1). (2), die geneigt PSF können stark vermeiden Sie Out-of-Focus Fluoreszenz und damit das Signal-Rausch-Verhältnis verbessern. (3) die optische Dichte von 100 bis 500 kW / cm2 bei der Beleuchtung PSF ermöglicht Tausende von Photonen aus einzelnen Fluorophore mit schnellen Erkennung Geschwindigkeiten (> 500 Hz) gesammelt werden. (4) die schnelle Erkennung Geschwindigkeit reduziert auch die räumliche Lokalisation Einzelmolekül-Fehler (< 10 nm) bei der Bestimmung der räumlichen Trajektorien fluoreszierende Moleküle in lebenden Zellen zu bewegen, weil molekulare Diffusion einer der wichtigsten Faktoren ist Unvollkommenheiten der Einzelmolekül-Lokalisierung für die Bewegung der Moleküle verursacht. (5) etablierte 2D zu 3D Umwandlung Algorithmen ermöglichen Ihnen 3D räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte Karten der Transportwege für Moleküle in der NPC oder der primäre Zilie zu bieten. Es ist bemerkenswert, dass unsere Konvertierung zwischen den kartesischen und den zylindrischen Koordinatensystem verwendet wird, um ein 3D räumliche Wahrscheinlichkeitsdichte Karte anstatt 3D Einzelmolekül-Tracking (Abbildung 2) zu generieren. Bisher haben Elektronenmikroskopie Daten zeigten, dass die NPC9,10 und die primäre Zilie11 beide eine rotationssymmetrische Struktur haben. Grundsätzlich sollte nach dem Zufallsprinzip diffundierende Moleküle durch die NPC oder primäre Zilie rotationssymmetrische Distributionen auch haben. Wie in Abbildung 2dargestellt, eine hohe Anzahl von nach dem Zufallsprinzip diffundierende Moleküle im Inneren des Zylinders erzeugt rotationssymmetrische Verteilungen der Querschnitt durch das in der NPC, weiter führt eine etwa gleichmäßige räumliche Verteilung innerhalb jeder sehr kleinen Sub-Region zwischen zwei benachbarten Ringen (Abb. 2E). Diese gleichmäßige Verteilung führt, dass die räumliche Verteilung entlang θ Dimension im zylindrischen System konstant ist. Dann können die 3D Koordinaten (X, R, θ) vereinfacht werden, um die 2D Koordinaten (R, X, konstante) werden. Eigentlich ist unsere Konvertierung zwischen den kartesischen und den zylindrischen Systemen von 2D (X, Y) in 2D (R, X, konstante). Die konstante θ bezieht sich auf die räumliche Dichte p in Abbildung 2E, wird berechnet, indem die Gleichung A
.
Letztlich Einzelmolekül-Tracking hat breite Anwendung in der biologischen Forschung, so ist es natürlich, dass eine Vielzahl von Techniken entwickelt, um spezifische biologische Nischen12,13,14füllen. Dies ist der Fall mit SPEED-Mikroskopie. Zuvor wurde zusammen mit einem 3D Transformationsalgorithmus diese Technik entwickelt, um 3D Transportwege von Transit-Moleküle durch die NPCs, eine sub-diffraction-Größe und rotationssymmetrische biologische Struktur6zu beheben. In diesem Papier primäre Zilien erweisen sich als ausgezeichnetes Modell Organellen sowie. Primäre Zilien sind zylindrisch, Antenne-wie Organellen (~ 125 nm Radius), die von der Oberfläche der meisten Säugetier-Zellen15,16,17zu projizieren. Sie sind verantwortlich für externe Signale empfangen und übertragen eine intrazelluläre Reaktion in der Regel verbunden mit Wachstum und Stoffwechsel15,16. Also flux von Strukturproteinen, recycling von transmembranen Rezeptoren und Übertragung von intrazellulären Botenstoffe sind wichtige Aufgaben der primären Zilien. An der Verbindungsstelle zwischen der primären Zilien und Zellkörper ist eine kritische Selektivität Schwelle, so genannte Übergangszone oder TZ, wodurch dieser Protein-Transport11,18,19erfolgen muss, 20. Neben der gating-Funktion von der TZ sind mindestens zwei Transportprozesse, intraflagellar Transport und passive Diffusion, vermutlich verantwortlich für die Bewegung des Proteins durch diese Region16,21, 22. aus Sicht der menschlichen Gesundheit, der Verlust der primäre Zilien und anschließenden Deregulierung der nachgeschalteten Signalisierung ist charakteristisch für viele Krebsarten. Darüber hinaus sind viele Erbkrankheiten wie Bardet-Bardet-Syndrom und polyzystischen Nierenerkrankung, defekte Protein Transport23zugeordnet. Die Größenbeschränkung von Sub-Beugung und den komplexen Prozess der selektiven Protein Transport durch die TZ machen die primären Zilien ein bevorzugtes Ziel für diese Technik. In diesem Methodenpapiers demonstrieren wir die Verfolgung von ciliary transmembranen Protein, Somatostatin Rezeptor 3 (SSTR3)24, extern mit Alexa Fluor 647 und Bestandteil des IFT, IFT2025, beschriftet mit einem geschmolzenen GFP-Molekül gekennzeichnet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der Geschwindigkeit Mikroskopie auf die primäre Zilie, ein zellulärer Signalisierung Organell, das hoch effiziente Protein Transport abhängig ist. Geschwindigkeit-Mikroskopie kann hochauflösende (< 10 nm) für Gewebekulturen beschriftet Moleküle bieten Durchschreiten der Einzelpunkt-Beleuchtung auf die TZ zentriert. Zuvor ist angewendet worden, um das Protein des Menschenhandels durch die NPC-6,7,<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Kristen Verhey (University of Michigan, Ann Arbor) und Dr. Gregory Pazour (University of Massachusetts Medical School) für die Bereitstellung von einigen Plasmide. Das Projekt wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (NIH-GM097037, GM116204 und GM122552, W.Y.).
Materials
| 25 cm2 tissue culture dish | Corning | VV-01936-00 | |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 10438018 | |
| DMEM | ThermoFisher | 10566-016 | |
| OPTIMEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 25300054 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P3813-1PAK | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35GCOL-0-14-C | |
| AlexaFluor 647-conjugated streptavidin | ThermoFisher | S21374 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| 633 nm He-Ne laser | Melles Griot | 25-LHP-928-249 | |
| 561 nm solid state laser | Coherent | OBIS 561-50 LS | |
| 488 nm solid state laser | Coherent | 1185053 | |
| Inverted fluorescence microscope | Olympus | IX81 | |
| 1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective | Olympus | UPLSAPO 100× | |
| On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera | Roper Scientific | Cascade 128+ | |
| Dichroic filter | Semrock | Di01- R405/488/561/635-25×36 | |
| Emission filter | Semrock | NF01-405/488/561/635-25X5.0 | |
| Slidebook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | digital microscopy software |
References
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