Summary
환경 내에서 곰 팡이 다양성을 결정 하는 것은 건강 위험을 식별 하기 위해 산업 보건 연구에 활용 방법입니다. 이 프로토콜 설명 증폭 및 곰 팡이 지역의 시퀀싱에 대 한 직업 공기 샘플에서 DNA를 추출을 합니다. 이 이렇게 많은 곰 팡이 종 전통적인 평가 방법에 의해 간과 수 있습니다 감지 합니다.
Abstract
문화와 현미경-기반 접근, 같은 직업 환경에서 곰 팡이 노출 식별의 전통적인 방법에는 많은 종류의 배제에 결과가 여러 제한이. 지난 2 년간 분야에서 발전 산업 보건 연구원 곰 팡이 위험 식별에 대 한 분자-기반 접근법을 주도 했습니다. 이러한 방법은 전통적인 방법을 사용 하 여 발견 되지 않은 실내 및 산업 환경에서 많은 종류의 탐지에서 이어지고 있다. 공기 내 곰 팡이 다양성을 결정 하기 위한 접근 게놈 DNA 추출, 증폭, 시퀀싱, 및 내부 곰 팡이의 분류학 식별을 통해 샘플이 프로토콜 세부 스페이서 (ITS) 영역을 복사할 수 있습니다. 많은 곰 팡이 종 하지 감지 또는 문화 또는 현미경을 사용 하 여 종 수준으로 식별 하기 어려운의 검출에는 시퀀싱 결과. 이러한 방법 곰 팡이 부담의 정량적 측정을 제공 하지 않습니다, 그러나 그들은 위험 식별에 대 한 새로운 접근을 제공 하 고 전체 종 부유 및 다양성 직업 환경 내에서 결정 하는 데 사용 수 있습니다.
Introduction
아니라 알레르기, 천식1를 포함 하 여 호흡기 morbidities 실내 및 산업 환경에서 곰 팡이 노출 될 수 있습니다. 곰 팡이 위험 식별 위험을 평가 하 고 작업자 노출 방지를 위해 중요 하다. 이 곰 팡이 위험 실내 오염, 실외 공기 침입, 또는 노동자는 존재2영역으로 곰 팡이 자료의 전송에서 발생 하는 환경 장애의 결과 수 있습니다. 뿐만 아니라 곰 팡이 포자의 미세한 식별 가능한 문화 샘플링 방법 곰 팡이 노출 평가를 포함 했다. 이러한 접근 방법은 몇 가지 제한 있고 전반적으로 곰 팡이 부담3에 기여 될 수 있는 많은 곰 팡이 종 종종 간과. 문화 기반 접근만 영양소 미디어에 재배 될 수 그 가능한 곰 팡이 균을 차별화할 수 있습니다. 현미경을 통해 종 수준으로 곰 팡이 포자를 식별 유사한 형태학을 공유 하는 포자에 의해 혼동 될 수 있습니다. 두 방법 모두 매우 mycologists 분석 하 고 많은 나머지 미확인으로 균 종 확인에 의존 하고있다.
직업 위험 식별 및 노출 평가에 사용 되는 기존의 방법론에 따라 개선 하기 위해 많은 연구 자들은 분자 기반 기술에 아닙니다. 시퀀싱-기반 접근 실내 및 산업 환경에서 미생물 다양성을 평가 하기 위한 현미경 등 가능한 문화3,4 방법에 비해 곰 팡이 발생의 광범위 한 스펙트럼을 계시 했다 ,5. 여기에 제시 된 방법 직업 환경의 공기 샘플링 및 잠재적인 균 위험 식별에 대 한 게놈 DNA의 추출에 설명 합니다. 위험 식별 핵 ribosomal 내부 베낀된 스페이서 또는 ITS, 버섯 중 매우 다양 하 고 일반적으로 곰 팡이 종6,7, 차별화 하는 데 사용 영역을 시퀀싱에 의해 수행 됩니다. 8,9. 많은 종 문 Basidiomycota에 속하는 일부 수 종 식별 가능한 문화에서 하지와 같은 직업 설정에서 발견 하 고 현미경으로 구분 하기가 어렵습니다. 이러한 버섯 시퀀싱 곰 팡이 그 지역3,,410평가 및 직업 환경에서 높은 관계 되는 풍부에 관찰 되었습니다. 그것의 시퀀싱 실내 및 산업 환경에서 발생 하는 버섯의 다양성에 더 큰 지식을 제공 하고있다.
프로토콜 여기 세부 정보 수집, 추출, 시퀀스 분석 bioaerosols에서 곰 팡이 ITS 영역 증폭 하는 데 사용 되는 방법을 설명 합니다. 이 방법은 공기에서 입자를 수집 직업 안전과 건강 (NIOSH) 2 단계 사이 클론 졸 샘플러의 국립 연구소를 활용 합니다. 이 샘플러 bioaerosols 그리고 분리 호흡 (≤4 µ m 공기 역학적 직경)를 수집 하기 위해 개발 되었습니다 및 비 호흡 (> 4 µ m 공기 역학적 직경) 대부분은 실내 환경에서 곰 팡이 생물의 식별을 위해 수 입자 작업자11에 의해 흡입 있을 것. 입자가 호흡 범위 내에서 수집 하는 능력을가지고 시장에 다른 공기 샘플러를 사이 클론 샘플러를 포함 하 여 사용할 수 있습니다 (< 4 µ m)12,13필터를 사용 하 여. 반면, NIOSH 2 단계 사이 클론 졸 샘플러 다운스트림 응용 프로그램14즉시 처리 될 수 있는 일회용, 폴 리 프로필 렌 튜브에 그들의 공기 역학적 직경에 따라 균 종을 분리 합니다.
게놈 DNA를 추출 하 고 곰 팡이 ITS 영역 증폭의 프로세스가이 프로토콜에 자세히 나와 있습니다. 많은 상용 키트 포유류 세포, 박테리아, 또는 특히 효 모15를 대상으로 추출 방법론 제시에서 균 류, 박테리아, genomic DNA 추출 위해 특별히 개발 되었습니다. 이 연구에 사용 된 뇌관은 곰 팡이 1와 그것의 2 지역4,5의 그들의 전체 범위에 따라 선택 됩니다. 이 지역의 시퀀싱 수 있습니다 그들을 포함 하 여 많은 은행된 ITS 시퀀스의 비교에 대 한 시퀀스의 1 지역, 그것의 2 지역, 또는 그것의 1와 그것의 2 지역. 공기 샘플의 곰 팡이 다양성 Ascomycota 그리고 Basidiomycota는 문의에 배치 하는 시퀀스와 같은 덜 지배적인 균 phyla에 속하는 다른 시퀀스의 상당한 수를 공개 이러한 방법을 표시 됩니다를 사용 하는 실내 설정에서 수집 Zygomycota입니다. 이 접근을 사용 하 여 식별 하는 곰 팡이 시퀀스의 광범위 한 다양성 재배 또는 현미경 같은 전통적인 위험 식별 방법론을 사용 하 여 캡처되지 않습니다 것입니다. 곰 팡이 영역의 시퀀싱 곰 팡이 위험을 식별 하 고 실내 및 산업 균 노출의 더 나은 이해를 허용 하는 향상 된 방법을 제공 합니다.
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Protocol
1. 준비 NIOSH 졸 샘플러
참고: NIOSH 졸 샘플러 bioaerosols 두 샘플링 튜브와 소계 (PTFE) 필터를 사용 하 여 수집 하는 2 단계 사이 클론 졸 샘플러가입니다.
- 어셈블리, 전에 조심 스럽게 샘플러를 검사 합니다. 그것을 보장 하기 위해 샘플러 손상 되지 않은, 장소 및 아늑한, 모든 나사가 및 경계선 주변 씰링 테이프는 2에 의해 형성 된 반쪽은 그대로. 샘플러 어떤 흠, 균열 또는 눈물 그리고 그것이 실리콘 그리스의 매우 가벼운 코팅 있지 않습니다 있도록 O-ring를 검사 합니다.
참고: 샘플러는 폴리스 티 렌 또는 폴 리 프로필 렌 3 종 필터 카세트에서 37 m m 3 µ m PTFE 필터를 포함합니다.- 기본 조각의 gridded 표면에 셀 루 로스 또는 플라스틱 필터 지원 패드 (필터 포함)을 배치 하 여 필터 카세트를 조립 ( 그림 1참조). 필터 집게를 사용 하 여 컬렉션 면이 필터 지원 패드 위에 필터를 넣어.
- 수동 또는 공 압 프레스를 사용 하 여 필터 카세트 인감. 손 폐쇄 공기 필터 주위 누출 하 수집 효율을 줄일 수 있습니다. 고리 모양의 조각 (확장 물통)를 삽입 하 고 언론을 사용 하 여 단단히 그리고 균등 하 게 그것을 밀어. 필터 주위 공기 누설 하지 않는 수 있도록 충분히 단단히 필터에 확장 물통 아래로 누릅니다.
참고: 카세트의 상단 부분 샘플링 하는 동안 사용 되지 않습니다 하지만 샘플링 완료 되 면 필터를 저장 한다. - 샘플러의 위에 조립된 카세트를 맞게 하 고 최대한 그것을 밀어. 외부 필터 카세트와 샘플러에에서 필터 카세트를 개최 하 고 누출을 방지 하기 위해 백업 인감 역할에 19mm (3/4 인치) 테이프의 조각을 래핑하십시오.
- 누수에 대 한 보조 인감 역할을 밖으로 바닥까지 샘플러 포장 바다 표범 어업 테이프 각 관 주위에 각 관을 단단히 하 고 완전히 나사.
참고: 첫 번째 튜브, 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브의 공기 역학적 직경 비 호흡 입자를 수집 > 4 µ m. 두 번째 튜브 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브 1 및 4 µ m 사이 호흡 입자를 수집합니다. 나머지 작은 입자, < 1 µ m, PTFE에 수집 되어 필터 ( 그림 2참조).
- 각 사용 하기 전에 보정 항아리와 NIOSH 샘플러를 통해 공기를 보정 필터 및 시료에서 차이 다를 공기를 발생할 것입니다.
- 교정 항아리를 사용 하려면 필터 카세트의 상단에 항아리의 루어 피팅 삽입, 샘플러, 항아리에 놓고 항아리를 밀봉 합니다.
- 샘플링 펌프 캘리브레이션 유량 계를 교정 항아리를 연결 합니다. 유량 계를 켜고 몇 분 동안 따뜻하게 수 있습니다. 참고 흐름 미터 항상 흐름 미터와 샘플러 오염 방지의 입구에 연결 된 필터를가지고 있어야 합니다.
- 샘플링 펌프를 켜고 따뜻하게 안정 하는 몇 분 동안 실행할 수 있도록.
- 조정 펌프 3.5 L/min에서 올바른 흐름 속도 설정 합니다.
참고: NIOSH 졸 샘플러 유량 3.5 L/min 일반적으로 설정 됩니다. 이 흐름 속도, 샘플러 호흡 입자 샘플링16ACGIH/ISO 기준에 따릅니다. 다른 흐름 레이트 다른 잘라 크기는 원하는 또는 소음 수준을 줄일 수 있지만 유의 다른 흐름 율을 사용 하는 경우 다음 샘플러는 더 이상 준수 호흡 샘플링 기준 하는 경우 사용할 수 없습니다. - 교정 끝나면 펌프와 유량을 끄십시오.
2. 정적 및 개인 졸 샘플링
- 어느 개인 또는 정적 영역 샘플링에 대 한 NIOSH 졸 샘플러를 설정 합니다.
참고: 정적 샘플링은 삼각대 또는 다른 저장 장치에 연결 하는 동안에 어로 졸 샘플러를 사용 하 여 (그림 3참조), 개인 때 샘플링 대 샘플러와 펌프는 ( 그림 4참조) 공부 되 고 사람에 탑재.- 정적 지역 샘플링에 대 한 계속 샘플러 특정 지역에 가능한 가깝게 공부 되 고. 공기 인 레트, 방 입구 및 공기 흐름의 경로에 있을 수 있는 장소에서 시료를 유지.
참고: 졸 농도가 달라질 수 있습니다 상당히 짧은 거리에도 졸 소스 방17에 있는 경우에 특히. - 개인 샘플링에 대 한 사용자의 호흡 영역 내 샘플러를 설정 합니다. 옷 깃, 어깨 또는 가슴, 샘플러를 부착 하 고 허리에서 또는 가방에 샘플링 펌프를 놓습니다.
참고: 호흡 영역은 주변 사람의 코는 대부분 공기의 흡입17동안 그려집니다 30 cm 반구로 일반적으로 간주 됩니다.
- 정적 지역 샘플링에 대 한 계속 샘플러 특정 지역에 가능한 가깝게 공부 되 고. 공기 인 레트, 방 입구 및 공기 흐름의 경로에 있을 수 있는 장소에서 시료를 유지.
- 튜브 샘플러 샘플러 후미의 잘 분명 하다 고 아무것도 방해 인 레트는 또는 샘플러에 공기 흐름에 방해가 있는지 확인 합니다. 튜브 샘플러 슬쩍 하거나 눌릴 해야 합니다 하지. 어떤 막힘 펌프를 중지 하면 됩니다.
- 펌프를 켭니다. 2 분 후 펌프 실행 중인 경우 확인 합니다.
참고: 행위 환경10,,1819에 따라 전체 8 h 작업 교대 10 분 만큼 적은에서 배열 하는 기간에 대 한 샘플링 공기. 그림 6 에 제시 하는 결과 실내 환경에서 60 분 샘플링 기간의 대표. - 공기 샘플링 완료 샘플 튜브와 필터를 수집 합니다. 봉인 테이프를 제거 하 고 나사 튜브, 그들 모자. 장소 필터에 필터 카세트의 세 번째 작품. 처리를 위해 준비 될 때까지 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
3. 공기 샘플에서 게놈 DNA 추출
- NIOSH BC251 샘플러의 각 단계에서 게놈 DNA (gDNA)를 추출 합니다. 샘플링 컬렉션 튜브 공기를 처리 하 고 샘플에서 호흡 및 호흡 비 미생물 졸의 결정에 대 한 수 있도록 별도로 필터링.
참고: 또는, 3 단계 수 수 결합 하 고 샘플 inoculum 너무 작으면 추출.- 클래스 II 생물 안전 캐비닛 또는 층 흐름 클린 벤치, aseptically 필터를 제거 합니다. 70% 에탄올과 지레 샘플링 카세트 카세트 오프닝 도구를 사용 하 여 열을 사용 하 여 샘플링 카세트를 닦아냅니다. 필터 기중 장치를 사용 하 여 필터 및 지원 패드를 위쪽으로 밀어. 잡고 집게를 필터를 사용 하 여 필터 멸 균 페 트리 접시에 놓습니다. 6 동일한 조각으로 필터를 잘라내어 300 mg 유리 구슬 (0.2-0.5 m m)를 포함 하는 강화 2 mL 튜브에 넣어.
- 30에 대 한 액체 질소에 필터를 포함 하는 튜브를 놓고 s 고 즉시에 4.5 m/s 30 설정 비드 밀 균질 화기 s.
- 반복 단계 3.1.2 번 필터 났습니다. 그대로 필터의 작은 조각에 남아 있을 수 있습니다. 세포의 용 해 버퍼 (4 M 요소, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), pH 7.4) 0.5 mL를 추가 합니다.
- 15 mL와 1.5 mL 공기 샘플러 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 0.3 mL를 추가 합니다. 와 10-15에 대 한 관 동 직 립 하면서 s와 다른 10-15 s 반전. 300 mg 유리 구슬을 포함 하는 강화 2 mL 튜브 각 튜브의 내용을 전송.
참고: 각 샘플러 튜브에 수집 된 자료의 대부분은 튜브의 상단 부근에 축적 됩니다. - 모든 튜브 비드 밀 균질 화기 4.5 m/s로 30 s와 원심 분리기에서에서 처리 그들 20000 x g 22 ° c.에 1 분에서 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브 supernatants 전송 및 22 ° c.에 1 분 동안 다시 20000 x g에서 튜브 원심 이 단계를 반복 합니다.
- 30 µ L 세포 시 약의 추가 ( 재료의 표참조) 각 튜브와 튜브 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 바인딩 버퍼 (10 M 요소, 6 M guanidine-HCl, 10 mM Tris HCl, 20% 트라이 톤 X-100, pH 4.4)의 0.2 mL를 추가 하 고 성분을 K (100 µ g/mL) 각 튜브와 튜브 각 튜브에 소 프로 파 놀의 10 분 추가 100 µ L 70 ° C에서 품 어.
- 유리 섬유 필터 튜브 (700 µ L 용량) 2 mL 컬렉션 튜브에 배치 추출 솔루션을 전송 하 고 20000 x g 30에 컬렉션 튜브 원심 22 ° c.에 s 컬렉션 튜브를 삭제 하 고 새로운 2 mL 컬렉션 튜브 필터 튜브 장소.
- 각 튜브를 억제제 제거 버퍼 (5 M guanidine-HCl, 20 mM Tris HCl, pH 6.6, 38% 에탄올) 0.5 mL를 추가 하 고 컬렉션 튜브 30 20000 x g에서 원심 22 ° c.에 s 컬렉션 튜브를 삭제 하 고 새로운 2 mL 컬렉션 튜브 필터 튜브 장소.
- 각 튜브를 워시 버퍼 (20 m m NaCl, 2 mM Tris HCl, pH 7.5, 80% 에탄올) 0.5 mL를 추가 하 고 컬렉션 튜브 30 20000 x g에서 원심 22 ° c.에 s 컬렉션 튜브를 삭제 하 고 새로운 2 mL 컬렉션 튜브 필터 튜브 장소. 이 프로세스를 반복 합니다.
- 모든 잔여 워시 버퍼를 제거 하려면 22 ° C에 추가 1 분에 대 한 20000 x g에서 컬렉션 튜브 원심 컬렉션 튜브를 삭제 하 고 새로운 컬렉션 튜브 필터 튜브를 배치.
- 추가 100 µ L를 각 튜브 (≥70 ° C) 차입 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 8.5) 따뜻하고 컬렉션 튜브 20000 x g 30에 1-2 분 원심 분리기에 대 한 실내 온도에 그들을 품 어 22 ° c.에 s Microcentrifuge 살 균 1.5 mL 튜브에 빈 필터 튜브를 전송 하 고 다시 단계 3.8에서에서 있다를 적용 합니다. 20000 x g 30에 1-2 분 원심 분리기에 대 한 실 온에서 품 어 22 ° c.에 s
참고: 있다 사용할 수 있습니다 즉시 단계 4 또는 사용할 준비가 될 때까지-20 ° C에서 저장에 대 한. Genomic DNA에 저장 될 수 있다-20 ° c.에서 1 년까지 장기 보관이 필요한 경우 DNA-80 ° C에 저장 되는 것이 좋습니다.
4입니다. 곰 팡이 ribosomal DNA의 증폭
- 보편적인 곰 팡이 프라이 머를 사용 하 여 그것의 지구 1와 2에서 추출한 gDNA 증폭.
참고:이 프로토콜에 대 한 뇌관 쌍 Fun18Sf (5'-TTGCTCTTCAACGAGGAAT-3') / ITS4R (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')는 지역4,5의 가장 큰 범위를 제공 하는 데 사용 됩니다. 혼자 ITS1 또는 ITS2 영역을 증폭 하는 다른 뇌관 세트를 사용할 수 있습니다.- 살 균 0.5 mL PCR 튜브 또는 96-잘 PCR 접시 triplicate 50 µ L 반응에서 각 샘플에 대 한 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)를 다음과 같이 설정: 5 µ L (3 단계)에서 추출 된 템플릿 DNA의 PCR 학년 물의 33.3 µ L, 10 x PCR 버퍼의 5 µ L 50 mM MgCl2의 1.5 µ L, 10 m m 2'-deoxynucleoside 5'-된의 1 µ L, 20 µ M Fun18Sf 앞으로 뇌관의 0.5 µ L, 20 µ M ITS4R 역 뇌관의 0.5 µ L 및 Taq DNA 중 합 효소의 0.2 µ L.
- 반응 열 cycler에서 수행: 3 분;에 대 한 95 ° C에서 변성 변성의 6 주기 (96 ° C, 30 s) 어 닐 링 (50 ° C, 45 s) 및 뇌관 연장 (72 ° C, 3 분); 변성의 20 주기 (96 ° C, 30 s), 어 닐 링 (50 ° C, 45 s), 및 뇌관 연장 (72 ° C, 1 분); 그리고 10 분을 위한 72 ° C에 뇌관 연장 다음 단계까지 4 ° C에서 반응 혼합물을 유지.
- 결합 triplicate PCR 반응 실리 카 멤브레인 기반 정화 키트를 사용 하 여 정화.
참고:이 절차는 PCR 구성 요소 (프라이 머, dNTPs, 효소, 소금, 등) 및 증폭 된 DNA 준비에서 다른 오염 물질의 제거에 대 한 수 있습니다.- 각 샘플 (총 150 µ L) 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 대 한 세 가지 반응 결합. 5 배 볼륨 (750 µ L)에서 바인딩 버퍼 (5 M guanidine-HCl, 30% 소 프로 파 놀)을 추가 하 고 10 번 위아래로 pipetting으로 솔루션을 혼합.
- 열 컬렉션 튜브에 배치 스핀 하 원심 17,900 x g에서 튜브 30 s. 삭제는 filtrates 혼합물의 450 µ L를 추가 합니다. 열에 나머지 450 µ L을 추가 하 고 30 17,900 x g에서 원심 22 ° c.에 s
참고: 스핀 열 열에 DNA의 흡착에 대 한 허용 하는 실리 카 멤브레인을 포함 됩니다. - filtrates을 삭제 하 고 스핀 열에 750 µ L 세척 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 7.5, 80% 에탄올)를 추가 합니다. 원심 17,900 x g 30에 열 22 ° c.에 s
참고:이 과정은 위에서 언급 한 PCR 반응에서 오염 물질을 제거 합니다. - 여과 액을 폐기 하 고 원심 17,900 x g 22 ° c.에 1 분 동안에 빈 열
참고:이 단계는 모든 잔여 세척 다운스트림 응용 프로그램을 방해할 수 있는 버퍼를 제거 하는. - 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 회전 열을 전송 합니다. 차입 버퍼 (10 mM Tris Cl, pH 8.5)의 45 µ L을 추가 하 고 5 분 원심 분리기에 대 한 실 온에서 튜브 17,900 x g 22 ° c.에 1 분 동안에 스핀 열을 품 어
- 단계 4와 5 단계 eluted DNA를 즉시 사용 하는 방법 또는 사용에 대 한 준비까지-20 ° C에서 저장.
참고:는 amplicons 저장할 수 있습니다-20 ° c.에서 1 년까지 장기 보관이 필요한 경우 DNA-80 ° C에 저장 되는 것이 좋습니다.
5. 곰 팡이 증폭 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 확인
- 캐스트는 1 %agarose 젤 포함 1 µ g/mL ethidium 평범한 사람. 분해 트리 스-아세테이트-EDTA (태) 버퍼 x 1을 끓는 agarose. 솔루션이 약 50 ° C에 냉각 하 고, 일단 ethidium 평범한 사람을 추가 하 고 주조 하는 젤으로 부 어.
- Agarose 젤은 경화 후 담가 1에서 젤 x TAE 젤에 적재 될 amplicons 준비. 증폭 된 DNA의 8 µ L, 버퍼 로드 x 5의 2 µ L 추가 합니다.
참고: 이러한 볼륨 원하는 로딩 버퍼의 농도 따라 조정할 수 있습니다. - 샘플, 크기 기준에 대 한 DNA 사다리와 함께 젤에 모든 10 µ L을 로드 합니다. 75 V에서 젤을 실행 (6 V/cm) 대략 90 분 및 밴드, 일반적으로 750 사이 본을 시각화 하 고 자외선을 사용 하 여 1, 000의 기본적인 쌍 라이트 ( 그림 5참조).
6. 시퀀싱 및 곰 팡이 영역의 분석
- Sequence gDNA 추출된 또는 곰 팡이 ITS 영역 증폭된 하 고 현재 하 고 적절 한 방법을 사용 하 여 시퀀스 분석.
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Representative Results
종 배포 환경 내에서 관계 되는 풍부의 공기 샘플에서 확인 된 각 OTU 클론의 수를 결정 하 여 평가 될 수 있습니다. 그림 6 는 공기 샘플링의 60 분에 따라 실내 환경 내에서 배치 taxonomically 종 대표 크로나 차트입니다. 그것은 종 문 Zygomycota (Rhizopus microsporus)에 속하는 두 개의 주요 곰 팡이 문의 Ascomycota Basidiomycota, 내 종의 다양 한 환경에 포함 되어 있음을 관찰할 수 있습니다. 평가의 전통적인 방법으로 많은 Basidiomycota culturable 또는 현미경 기반 방법을 사용 하 여 분화 될 수 없다 Ascomycota 종으로 바이어스는. 곰 팡이 지역의 시퀀싱 수많은 균 종, 특히 일부 Basidiomycota, 자주 들 키 지 않고가 감지 할 수 있습니다. 이 환경의 분석 확인 곰 팡이 시퀀스의 68% 소유는 Basidiomycota 순서 Polyporales에 그들의 대부분과 함께 보여줍니다.
시퀀싱-기반 접근을 사용 하 여 얻은 분류학 데이터 환경 내에서 분류학 다양성을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 표 1에 제시 등 다양성 지표 결정 뿐만 아니라 얼마나 다양 한 환경입니다, 종 수와 풍요의 계정에 소요 얼마나 부자 환경 이다는 각 샘플에서 확인 된 종의 수에 설명 합니다. 각. 표 1 두 개의 실내 환경에 대 한 다양성 인덱스 차오 1 풍부한 인덱스와 섀 넌 보여준다. 인덱스가 더 높은 풍부 함과 다양성 증발 냉각기 환경에 비해 에어컨된 환경에서 나타냅니다. 브 레이 커티스 비슷하지 계수는 또한 포함 됩니다. 이러한 환경 내에서 지정 샘플 설명 각 샘플 내에서 확인 된 종에 관한 있습니다. 두 표 1에 설명 된 환경 내에서 샘플은 각각 98%, 97% 에어컨 및 증발 냉각기 환경에 매우 비슷하지.
그림 1: 3 종 필터 카세트 어셈블리의 도식 대표. 필터 카세트 3 개 구성: 상단 또는 모자 조각 (입구), 확장 물통 및 기본 조각 (콘센트). 지원 패드 및 필터 기본 조각의 gridded 표면에 배치 됩니다. 확장 물통 다음 수동 또는 공 압 프레스를 사용 하 여 자료에 밀봉 된다. NIOSH bioaerosol 사이 클론 샘플러와 함께 사용 하기 위해 상단 부분 샘플링 동안 중단 하 고 저장과 수송에 대 한 대체 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: NIOSH bioaerosol 사이 클론 샘플러의 도식 대표. NIOSH 사이 클론 졸 샘플러는 입구를 통해 샘플러에 공기 샘플 튜브의 벽에 입자를 예금 하는 사이 클론을 생산 여 공중 미 립 자를 수집 합니다. 어디 큰 공기 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 먼저 그려진 입자 (> 4 µ m) 튜브의 벽에 수집. 다음 첫 번째 튜브 흐르는 공기와 그려집니다 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 작은 입자 (1 ~ 4 µ m) 수집. 나머지 입자 (< 1 µ m) 수집 PTFE 필터에 공기 견본집에서 그려집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 정적 샘플러 설정의 예. 이미지 정적 영역 샘플링에 대 한 설정 하는 샘플을 보여 줍니다. NIOSH 샘플러 설정 됩니다 수집 40 인치 (102 cm) 및 60 인치 (152cm) 바닥에서 앉아와 서 성인의 높이 각각 나타내는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 개인 샘플러 어셈블리의 예. 이미지는 개인 배낭에 착용 NIOSH 샘플러를 보여 줍니다. 샘플러와 전원 스위치는 샘플링 펌프 자체 배낭 내에 있는 동안 팩의 결박에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 예제는 agarose 젤 시각화의 공기 견본에서 그것의 DNA 증폭. 이미지는 750 / 1000 기본 쌍 사이의 DNA 밴드를 보여줍니다. 이러한 밴드 추출된 공기 샘플에서 증폭 된 곰 팡이 영역을 나타냅니다. 그것의 지역 종 기원에 따라서 크기에서 변화 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 실내 환경 내에서 식별 하는 곰 팡이 종 배치 taxonomically 예제 크로나 차트 제시. 크로나 차트 NIOSH bioaerosol 사이 클론 샘플러와 함께 60 분 공기 샘플링 기간 뒤 가정에서 수집 된 4 샘플에서 발견 하는 균 종의 관계 되는 풍부를 보여준다. 종 확인의 68% 나머지 속하는 Ascomycota (33%)와 Zygomycota (1%)와 문 Basidiomycota에 속한다. 이 환경에서 가장 풍부한 ITS 시퀀스 순서 Polyporales에 속한 고 Phanerodontia chrysosporium Gelatoporia dichroa로 확인 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
차오 1 풍부 | 섀 넌 다양성 | 브 레이 커티스 거리 | |
(최소, 최대)를 의미 | (최소, 최대)를 의미 | (최소, 최대)를 의미 | |
에 어 컨디셔너 (n = 9) | (15.0, 102.0) 33.86 | 1.39 (0.68, 2.51) | 0.9778 (0.8313, 1.00) |
증발 냉각기 (n = 10) | 25.46 (12.5, 49.5) | 1.10 (0.50, 1.72) | 0.9624 (0.3804, 1.00) |
표 1: 예제 데이터 제시 다양성 및 종 부유 인덱스 실내 환경 비교. 차오 1 풍부한 인덱스 (샘플 당 종의 수), 논 다양성 지 수 (종 수)과 각각의 풍요로 움 그리고 브 레이 커티스 비슷하지 계수 표 (지정 종 분포는 0-규모 샘플 사이 1). 이러한 데이터 더 높은 풍부 함과 다양성 공기 환경 및 두 환경 모두에서 샘플 중 높은 호환성을 보여 줍니다. 이 테이블은 레몬 외에서 수정 되었습니다. 화학의 왕 사회 허가 10 .
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Discussion
시퀀싱 기반 방법을 사용 하 여 직업 환경 내에서 곰 팡이 다양성을 결정 하는 것은 곰 팡이 위험 식별 및 노출 평가 개선 했다. 이 방법을 사용 하는 많은 종의 추가 곰 팡이 종종 문화 또는 평가의 현미경-기반 메서드를 사용 하 여 검색 검색에 대 한 허용 했다. 직업 및 실내 환경 및 그것의 증폭 및 시퀀싱에 대 한 공기 샘플에서 게놈 DNA 추출에서 bioaerosols 샘플링 하는 방법은 여기에 제공 됩니다. 이러한 방법을 사용 하 여 곰 팡이 다양성의 결정은 높게에 지: (1) 성공 하 고 완전 한 genomic DNA에서에서 추출 공기 샘플링, 틀에 그 시퀀스는 증폭의 비교에 대 한 허용 하는 뇌관으로 gDNA의 확대 (2) 데이터베이스 및 한도 확대 편견, 및 (3) 올바른 분류학 식별 데이터베이스 내에서 시퀀스의 시퀀스입니다.
게놈 DNA 추출은 추출 방법론 및 연구에 사용 하는 시 약에 의존. 프로토콜에 언급은 튜브의 상단에 있는 bioaerosols 그리고 다른 생물과 비 생물 입자 NIOSH 2 단계 사이 클론 샘플러의 관 단계에서 수집 된의 많은 수집 합니다. 튜브 잃을 모든 입자를 세포의 용 해 버퍼를 추가 하는 경우에 신중 하 게 열 수 및 그들은 세포의 용 해 버퍼 (오른쪽 고 거꾸로 다운)으로을에 모든 미 립 자에 대 한 허용 하는 방식으로 vortexed 될 매우 중요 하다. 그것은 또한 필터 신중 하 게 될 중요 한 이전 추출 표면에 수집 하거나 오염 DNA 소개 bioaerosols 중단을 무 균 메서드를 사용 하 여 처리. 그것은 상업적으로 사용 가능한 게놈 DNA 추출 키트15의 많은 사이 변이의 다량은 입증 되었습니다. 특정 균 종 및 결과 다양 한 DNA에 일부 추출 절차 바이어스20을생성합니다. 다음 추출 DNA 수율 낮은 경우 높은 PCR 반응 복제를 수행할 수 있습니다. 뿐만 아니라 추출 수율 변화, 그러나 많은 키트의 상당한 양의 미생물 DNA 오염 기여. 이러한 이유로, 그것은 식별 하 고 분석에서 잠재적인 시 오염 물질을 제거 하는 절차를 통해 적절 한 컨트롤을 포함 하는 것이 중요.
그 증폭 프로토콜의 또 다른 중요 한 단계입니다. 사용 하는 추출 방법론 환경 샘플에서 PCR 억제제를 제거 하는 그들의 기능에서 달라질 수 있습니다. 이것은 특히 환경 먼지 샘플21염려 이다. 여기에 제시 된 방법을 사용 하 여 추출 하는 샘플의 PCR 증폭 먼지15의 10 밀리 그램의 추가 후 일부 PCR 저해 전시. PCR 저해 환경 먼지 샘플의 가장 큰 관심사의 이더라도, 곰 팡이 다양성을 결정 하기 위한 공기 샘플에서 추출한 DNA를 증폭 하는 때 아직도 고려 되어야 합니다. 이 방법에 사용 된 설정 PCR 뇌관의 1와 그것의 2 지역 범위를 제공 합니다. 시퀀스 시퀀스 데이터베이스에 배치의 많은 비교 가능 합니다. 추출 프로시저와 마찬가지로 많은 증폭 및 뇌관 편견 이전 기술된22되었습니다. 균 게놈 크기와 유전자 복사 번호를의 증폭23에 또한 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 편견 결과 시퀀스 데이터를 해석할 때 고려 사항으로 취해야 한다. 그 시퀀스의 분류학 식별 아마도이 방법의 가장 중요 한 구성 요소입니다. 그것은 식별 기준 일관성을 유지 해야 합니다. 해당 시퀀스를 식별 하는 기능 데이터베이스에 틀 시퀀스에 따라 달라 집니다. 많은 시퀀스 종 수준으로 확인 될 수 없습니다. 때 분류학 식별 비율 정체성 차단 같은 은행된 시퀀스에 따라 특정 기준을 갖는 것은 일관 된 연구에서 연구 데이터 집합 유지 중요 합니다.
전통적인 평가 방식에 비해, 추출 및 직업 공기 샘플에서 곰 팡이 DNA 시퀀싱 환경 내에서 곰 팡이 다양성의 더 완전 한 표현을 수 있습니다. 위에서 설명한 제한 이외에 그것은 이러한 유형의 분석의 결과 반 문화, 포자 수, 또는 양이 많은 PCR24 양적 데이터를 얻을 수 있습니다 달리 양적 주목 해야 합니다. 샘플 당 관계 되는 풍부를 결정 하 고 곰 팡이 다양성 통계 계산 시퀀싱 데이터를 사용할 수 있습니다. 이러한 방법은 함께에서 정량, 같은 다른 방법으로 더 많은 정량 데이터를 사용할 수 있습니다. 이러한 방법을 사용 하 여 만든 데이터 집합 특정 직업 환경에서 곰 팡이 위험의 더 나은 이해를 얻기 위해 산업 보건 연구에 사용할 수 있습니다. 더 표준화 된 추출 및 뇌관 선택의 접근은 더 나은 특성 및 곰 팡이 다양성의 시퀀싱 기반 연구를 비교 하는 데 필요한 개발.
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Disclosures
결과 및 결론은이 보고서에는 작가 이며 반드시 질병 관리 및 예방에 대 한 직업 안전 및 건강, 센터에 대 한 국립 연구소의 공식적인 위치를 대표 하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIOSH와 NIEHS (AES12007001-1-0-6) 사이 부처간의 합의 의해 부분에서 지원 되었다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
References
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