En enkel og effektiv metode til In Vivo hjerte-specifikke genmanipulation af Intramyocardial injektion i mus
Summary
Her præsenterer vi en protokol for hjerte-specifikke genmanipulation i mus. Under anæstesi, var musen hjerter externalized gennem den fjerde interkostale rum. Efterfølgende, blot adenovirus kodning specifikke gener blev sprøjtet med en sprøjte ind i myokardiet, efterfulgt af protein udtryk måling via i vivo billeddannelse og Western analyse.
Abstract
Genmanipulation specifikt i hjertet forstærke betydeligt undersøgelse af hjertesygdom patomekanismer og deres terapeutiske potentiale. In vivo hjerte-specifikke gen levering er almindeligt opnås ved enten systemiske eller lokale levering. Systemisk injektion via hale vene er nemt og effektivt i manipulere hjerte genekspression ved hjælp af rekombinante adeno-associeret virus 9 (AAV9). Men denne metode kræver en forholdsvis stor mængde af vektor for effektiv transduktion, og kan resultere i nontarget orgel gen transduktion. Her, beskriver vi en enkel, effektiv og tidsbesparende metode af intramyocardial injektion for i vivo hjerte-specifikke genmanipulation i mus. Under anæstesi (uden ventilation), større og mindre brystmuskulaturen var ligefremt dissekeret, og musen hjertet var hurtigt udsat af manuel udlægning gennem et lille snit på den fjerde interkostale rum. Efterfølgende, blev adenovirus kodning luciferase (Luc) og vitamin D-receptoren (VDR) eller korte hårnål RNA (shRNA) rettet mod VDR, sprøjtet med en Hamilton sprøjte ind i myokardiet. Efterfølgende i vivo billeddannelse demonstreret at luciferase var med held overexpressed specielt i hjertet. Endvidere, vestlige skamplet analyse bekræftet den succesfulde overekspression eller hæmning af VDR midt mus. Når først beherskes, kan denne teknik bruges til genmanipulation, som indsprøjtning af celler eller andre materialer som nanogels midt mus.
Introduction
Hjertesygdom er den hyppigste årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan1,2. Manglen på effektive terapeutiske strategier for livstruende hjertesygdomme myokardieinfarkt og hjertesvigt tiltrækker intensiv efterforskning af underliggende patomekanismer og identifikation af nye terapeutiske muligheder3. For disse videnskabelige udforskninger er hjerte-specifikke genmanipulation udbredte4,5. Hjerte genmanipulation kan opfyldes af genom-redigering ved hjælp af kraftfulde transkription aktivere-lignende effektor nukleasen (TALEN) og grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) / CRISPR forbundet protein 9 (Cas9) værktøjer, eller ved levering af ektopiske genetiske materiale (fx, virus vektorer bærer gener kodning proteiner af interesse)6. Selvom genom-redigering giver præcise og spatiotemporelle genom ændringer i levende mus, er det stadig en tidskrævende og arbejdskrævende praksis6. Alternativt, hjerte-specifikke genmanipulation af virus vektor eller små blande RNA (siRNA) komplekse levering er rutinemæssigt udføres6.
Virus vektor levering til voksen mus hjertet opnås ved omtrent to strategier: systemiske eller lokale injektion. Systemisk injektion af cardiotropic serotype af AAVs såsom AAV9 er noninvasive for hjerte bestemt gen manipulation7. Men denne metode kræver en forholdsvis stor mængde af vektor nødvendigt for effektiv transduktion og genekspression, og kan resultere i betydelige transduktion af nontarget organer såsom muskel og lever7. Lokale virus injektion er opnået ved intramyocardial injektion eller Intrakoronar levering7. Intrakoronar levering fører til en mere jævn fordeling af virus i hjertet sammenlignet med intramyocardial injektion. Men ulemperne ved denne teknik er den hurtig vask ud af virale vektorer til systemisk cirkulation og transduktion i nontarget organer8, og dets krav om udstyr til trykmåling under operationen. Derimod vektor intramyocardial injektion giver bedre virus fastholdelse i myokardiet samt stedsspecifik levering, men det mislykkes at jævnt distribuere viral7. For små dyr er Intrakoronar levering teknisk vanskeligt at udføre, mens systemiske AAV9 injektion og intramyocardial injektion er mere almindeligt praktiseres4,5,7. Selvom systemisk injektion er nem at udføre, konventionelle intramyocardial injektion kræver mekanisk ventilation og torakotomi, forårsager omfattende vævsskader, og er tidskrævende.
I denne betænkning beskrevet vi en let, tidsbesparende og yderst effektiv metode til intramyocardial injektion. Adenovirus kodning luciferase og VDR eller shRNA målretning VDR, blev sprøjtet for at manipulere hjerte genekspression. Når først beherskes, kan denne metode bruges til genmanipulation, som indsprøjtning af celler eller andre materialer i mus hjertet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den aktuelle betænkning viser en modificeret teknik for intramyocardial injektion af virale vektorer for kardiale genmanipulation, som blev ændret fra en metode for myokardieinfarkt induktion af Gao et al. 13 i øjeblikket, i vivo karakterisering af bestemte gen funktioner oftest involverer generation af knockout eller Transgene mus3,14,15,16,</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Science Fond for fremtrædende unge forskere (81625002), National Natural Science Foundation of China (81470389, 81270282, 81601238), programmet for Shanghai akademisk Forskningsleder (18XD1402400), Shanghai Municipal Uddannelse Kommissionen Gaofeng klinisk medicin tilskud (20152209), Shanghai Shenkang Hospital Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong University (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 og 14XJ10019), Shanghai sejlads Program (18YF1413000), og Postgraduate Innovation Program af Bengbu Medical College (Byycx1722). Vi takker Dr. Erhe Gao for hans tidligere hjælp i vores laboratorium.
Materials
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW | |
References
- Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
- Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
- He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
- Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
- He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
- Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
- Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
- Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
- Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
- Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
- Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
- de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
- Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
- Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
- Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
- Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).
