En enkel og effektiv metode i Vivo hjerte-spesifikke Gene manipulering av Intramyocardial injeksjon i mus
Summary
Her presenterer vi en protokoll for hjerte-spesifikke genet manipulasjon i mus. Under narkose, var musen hjerter eksternaliserte gjennom Fjerde interkostalrom plass. Deretter blot adenoviruses koding bestemte gener ble injisert med en sprøyte i myokard, etterfulgt av protein uttrykk måling via i vivo bildebehandling og Western analyse.
Abstract
Gene manipulasjon i hjertet forsterke betydelig etterforskningen av cardiac sykdom pathomechanisms og deres terapeutiske potensial. I vivo hjerte-spesifikke gen levering oppnås vanligvis ved systemisk eller lokal levering. Systemisk injeksjon via hale vene er enkel og effektiv i å manipulere cardiac genuttrykk ved hjelp av rekombinant adeno-assosiert virus 9 (AAV9). Men denne metoden krever en relativt stor mengde vektor for effektiv signaltransduksjon, og kan resultere i nontarget orgel genet signaltransduksjon. Her beskriver vi en enkel, effektiv og tidsbesparende metode for intramyocardial injeksjon i vivo hjerte-spesifikke genet manipulering i mus. Under anesthesia (uten ventilasjon), pectoral hovedversjoner og underordnede musklene var rett ut dissekert og mus hjertet ble raskt eksponert av manuell eksternalisering gjennom et lite innsnitt på den fjerde interkostalrom plassen. Deretter ble adenovirus koding luciferase (Luc) og vitamin D reseptor (VDR), eller kort hårnål RNA (shRNA) målretting VDR, injisert med en Hamilton sprøyte i myokard. Senere i vivo imaging viste at luciferase var vellykket overexpressed i hjertet. Videre bekreftet Western blot analyse den vellykkede overuttrykte eller stanse VDR i musen hjertet. Når mestret, kan denne teknikken brukes til genet manipulasjon, samt injeksjon av celler eller andre materialer som nanogels i musen hjertet.
Introduction
Hjertesykdom er den ledende årsaken til sykelighet og dødelighet verdensomspennende1,2. Mangel på effektive strategier for livstruende hjertesykdommer inkludert hjerteinfarkt og hjertesvikt tiltrekker intens utforskningen av underliggende pathomechanisms og identifikasjon av romanen behandlingsalternativer3. For disse vitenskapelige undersøkelser er hjerte-spesifikke genet manipulasjon brukte4,5. CARDIAC genet manipulasjon kan oppnås ved genome redigering med kraftig transkripsjon aktivator som effektor nuclease (TALEN) og gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) / CRISPR forbundet protein 9 (Cas9) verktøy, eller levering av ektopisk genetisk materiale (f.eks, virus vektorer bærer gener som koder proteiner av interesse)6. Om genomet redigering gir presis og spatiotemporal Genova endringer i levende mus, er det fortsatt en tidkrevende og arbeidskrevende6. Alternativt, hjerte-spesifikke genet manipulering av virus vektor eller lite forstyrrende RNA (siRNA) komplekse levering er rutinemessig utført6.
Virus vektor levering til voksen mus hjertet oppnås ved omtrent to strategier: systemisk eller lokale injeksjon. Systemisk injeksjon av cardiotropic serotype av AAVs som AAV9 er noninvasive for cardiac bestemte genet manipulasjon7. Men denne metoden krever en relativt stor mengde vektor nødvendig for effektiv signaltransduksjon og genekspresjon, og kan medføre betydelig signaltransduksjon nontarget organer som muskel og leveren7. Lokale virus injeksjon oppnås ved intramyocardial injeksjon eller intracoronary levering7. Intracoronary levering fører til en jevnere fordeling av virus i hjertet sammenlignet intramyocardial injeksjon. Men er ulempene med denne teknikken rask vask ut av viral vektorer til systemisk sirkulasjon og signaltransduksjon nontarget organer8og flyprodusentene enheter for press måling under operasjonen. I motsetning vektor intramyocardial injeksjon muliggjør bedre virus oppbevaring i myokard samt stedsspesifikke levering, men det unnlater å jevnt distribuere viral7. For små dyr er intracoronary levering teknisk vanskelig å utføre, systemisk AAV9 injeksjon og intramyocardial injeksjon er ofte praktisert4,5,7. Om systemisk injeksjon er enkel å utføre, konvensjonelle intramyocardial injeksjon krever mekanisk ventilasjon og thoracotomy forårsaker omfattende vevsskade og tidkrevende.
I denne rapporten beskrev vi en enkel, tidsbesparende og svært effektiv metode for intramyocardial injeksjon. Adenovirus koding luciferase og VDR eller shRNA målretting VDR, ble injisert for å manipulere cardiac genuttrykk. Når mestret, kan denne metoden brukes for genet manipulasjon, samt injeksjon av celler eller andre materialer i musen hjertet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gjeldende rapport viser en modifisert teknikk for intramyocardial injeksjon av viral vektorer for cardiac genet manipulasjon, som ble endret fra en metode for hjerteinfarkt induksjon av Gao et al. 13 for tiden i vivo karakteristikk av bestemte genet funksjoner oftest involverer generering av knockout eller transgene mus3,14,15,16,<sup class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Science Fund for fremragende unge forskere (81625002), National Natural Science Foundation i Kina (81470389, 81270282, 81601238), programmet i Shanghai akademisk forskningsleder (18XD1402400), Shanghai Municipal Utdanning kommisjonen Gaofeng klinisk medisin gi støtte (20152209), Shanghai Shenkang Hospital Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong University (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 og 14XJ10019), Shanghai seiling Program (18YF1413000) og høyere innovasjon Program for Bengbu Medical College (Byycx1722). Vi takker Dr. Erhe Gao for hans tidligere hjelp i vår lab.
Materials
| Equipments | |||
| Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
| Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
| High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
| Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
| IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
| Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
| Instruments | |||
| Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
| Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
| Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
| Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
| Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
| Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
| 1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
| Materials and reagents | |||
| Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
| Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
| Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
| Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
| Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
| Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
| Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
| Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
| Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
| EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
| Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
| Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
| Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
| Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
| Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
| PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
| 5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
| Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
| Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
| Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW | |
References
- Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
- Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
- He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
- Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
- He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
- Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
- Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
- Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270 (2016).
- Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
- Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
- Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
- Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
- de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
- Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
- Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
- Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
- Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
- Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
- Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064 (2014).
