फोकल माइक्रोस्कोपी छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से कोशिका सतह रिसेप्टर एकत्रीकरण का पता चलता है
Summary
एंटीबॉडी कि बाँध सेल सतह पर रिसेप्टर्स लक्ष्य करने के लिए अनुरूप और क्लस्टरिंग परिवर्तन प्रदान कर सकते हैं. इन गतिशील परिवर्तन निस्र्पक दवा के विकास के लिए लक्ष्य कोशिकाओं में निहितार्थ है । इस प्रोटोकॉल ImageJ/फिजी के माध्यम से फोकल माइक्रोस्कोपी और छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी का इस्तेमाल करता है कोशिका सतह पर रिसेप्टर क्लस्टरिंग की हद तक बढ़ाता है ।
Abstract
फोकल माइक्रोस्कोपी उप सेलुलर बातचीत के लक्षण वर्णन और पूर्व नैदानिक फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल एजेंटों के विकास के लिए महत्वपूर्ण पर कब्जा करने के लिए एक सुलभ पद्धति प्रदान करता है । एंटीबॉडी आधारित साइटोटोक्सिक दवा वितरण प्रणाली में हाल ही में प्रगति के साथ, रिसेप्टर एकत्रीकरण और internalization के दायरे के भीतर इन एजेंटों द्वारा प्रेरित परिवर्तन को समझना महत्वपूर्ण महत्व का है. इस प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट immunocytochemistry की अच्छी तरह से स्थापित पद्धति और ImageJ के मुक्त स्रोत फिजी वितरण leverages, अपनी इनबिल्ट सहसंबंध और छवि गणितीय कार्यों के साथ, के लिए स्थानिक छवि सहसंबंध प्रदर्शन स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीएस) । इस प्रोटोकॉल फोकल माइक्रोस्कोप की किरण क्षेत्र के एक समारोह के रूप में लेबल रिसेप्टर्स की फ्लोरोसेंट तीव्रता quantitates. यह सेल सतह पर लक्ष्य अणु एकत्रीकरण की स्थिति का एक परिमाणात्मक उपाय प्रदान करता है । इस पद्धति की क्षमता के साथ स्थिर कोशिकाओं के लक्षण वर्णन पर केंद्रित है रिसेप्टर एकत्रीकरण के लौकिक जांच में विस्तार करने के लिए । यह प्रोटोकॉल एक सुलभ पद्धति प्रस्तुत करने के लिए क्लस्टरिंग घटनाओं की ठहराव प्रदान करने के लिए सेल की सतह पर होने वाली, अच्छी तरह से स्थापित तकनीक और गैर विशेष इमेजिंग उपकरण का उपयोग ।
Introduction
चिकित्सीय एंटीबॉडी के विकास के कई ट्यूमर प्रकार के उपचार में उल्लेखनीय सफलता दिखाया गया है1. एंटीबॉडी के हाल ही में प्रगति-ड्रग conjugates (ADC) साइटोटोक्सिक यौगिकों के लिए वितरण तंत्र के रूप में एंटीबॉडी की गतिशीलता को समझने के लिए आवश्यकताओं का विस्तार किया गया है: सेल सतह2पर रिसेप्टर बातचीत. सेल सतह रिसेप्टर के लिए एक एंटीबॉडी के सफल लक्ष्यीकरण के बाद, इन परिसरों ligand में मनाया उन लोगों के लिए समान एकत्रीकरण पैटर्न पैदा कर सकते हैं: एंटीबॉडी बातचीत3. रिसेप्टर एकत्रीकरण में परिवर्तन झिल्ली और रिसेप्टर के internalization में परिणाम और सेल सतह से हटाने के लिए बदलाव पैदा कर सकते हैं. एक एंटीबॉडी के संदर्भ में दवा संयुग्मी, इस प्रक्रिया को बाद में आंतरिक endosomes में साइटोटोक्सिक पेलोड विज्ञप्ति और बाद में कोशिका द्रव्य, प्रभावी कोशिका हत्या में जिसके परिणामस्वरूप ।
फोकल माइक्रोस्कोपी एंटीबॉडी के इन महत्वपूर्ण बातचीत visualizing और उनके लक्ष्य रिसेप्टर्स4की एक प्रभावी साधन प्रदान की गई है । सेल सतह पर लक्ष्य अणु के एकत्रीकरण के परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल एक स्थानिक छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीएस) तकनीक 5,6,7 के माध्यम से फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों के प्रसंस्करण के बाद .
छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी की नींव अवलोकन है कि स्थानिक प्रतिदीप्ति तीव्रता उतार चढ़ाव लेबल संरचनाओं के घनत्व और एकत्रीकरण राज्य के लिए एक रिश्ता साझा है । यह संबंध एक कैप्चर की गई छवि5के एक स्थानिक सहसंबंध फ़ंक्शन की गणना के बाद स्थापित किया गया है ।
छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के सभी वेरिएंट एक छवि के संबंध की गणना की आवश्यकता होती है । यह इस फ़ंक्शन के लिए एक दो-आयामी गाऊसी वक्र छवि के भीतर निहित मात्रा एकत्रीकरण स्थिति पैरामीटर्स के निष्कर्षण के लिए ढाले द्वारा फ़ॉलो किया जाता है । सरल शब्दों में एक छवि की गणना एक छवि के भीतर निहित सभी संभव पिक्सेल जोड़े तुलना शामिल है और संभावना है कि दोनों समान रूप से एक दूसरे के रूप में उज्ज्वल की गणना । यह दूरी और पिक्सेल जुदाई8की दिशाओं के एक समारोह के रूप में visualized है ।
छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए सैद्धांतिक ढांचे की स्थापना की और पीटरसन और ज्ञानी एट अलद्वारा परिभाषित किया गया था । 5 , 6. इस प्रोटोकॉल में, ImageJ में एक स्प्रेडशीट अनुप्रयोग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, तीव्रता उतार-चढ़ाव स्थानिक सहसंबंध फ़ंक्शन के लिए आधार (Eq 1)के रूप में वर्णित किया जा सकता है, तो सहसंबंध परिकलन किया जाता है:
जहां च रूपान्तर रूपांतर का प्रतिनिधित्व करता है; F− 1 विलोम रूपान्तर रूपांतरित; च * इसकी जटिल संयुग्मी; आणि स्थानिक क्षेत्रातही चर ε आणि η. स्थानिक आईसीएस में, इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में, सहसंबंध फ़ंक्शन एक 2d तेजी रूपान्तर रूपांतरण एल्गोरिथ्म7,9का उपयोग कर परिकलित किया जा सकता है । शूंय स्थानिक अंयथा शूंय-अंतराल, जी11(0, 0), के रूप में जाना जाता जुदाई में सहसंबंध माइक्रोस्कोप की किरण क्षेत्र प्रति वर्तमान कणों के व्युत्क्रम मतलब की संख्या प्रदान करता है । यह एक दो आयामी गाऊसी समारोह (Eq 2)के लिए स्थानिक सहसंबंध समारोह फिटिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है:
के रूप में पिक्सल एक छवि के भीतर कब्जा कर लिया एक सेट क्षेत्र के भीतर समाहित कर रहे है और इन माप अनंत को विस्तार नहीं है, शब्द जी ∞ एक ऑफसेट के रूप में प्रयोग किया जाता है के लिए लंबी दूरी की स्थानिक सहसंबंध के लिए खाते में निहित छवि । आणविक आकार समुच्चय के लिए, ω माइक्रोस्कोप की बात फैलाने के समारोह और स्थानिक सहसंबंध समारोह की आधी अधिकतम पर पूर्ण चौड़ाई द्वारा वर्णित है है । साधन के बिंदु प्रसार समारोह के भीतर निहित क्षेत्र उप संकल्प फ्लोरोसेंट मोतियों के उपयोग के माध्यम से जांच कर सकते हैं ।
यहां वर्णित छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रोटोकॉल के लिए, एकीकृत परिपथों को पूरा करने के लिए आवश्यक सहसंबंध और गणितीय फ़ंक्शंस खुले स्रोत इमेजिंग-प्रोसेसिंग प्लेटफ़ॉर्म, फिजी10, ImageJ के वितरण का उपयोग कर रहे हैं । कार्यक्रम११,१२. फिजी/ImageJ FFT मठ समारोह में पूर्व स्थापित तेजी से रूपान्तर परिवर्तन का इस्तेमाल करता है । यह फ़ंक्शन प्रत्येक आयाम13में दो के एक फ़ैक्टर द्वारा डेटा की श्रेणी को कम करके इस परिकलन की आवश्यक गणना समय को कम करता है. के रूप में 2 डी सहसंबंध समारोह एक्स में लगभग सममित है, वाई धुरी, एक एकल रेखा प्रोफ़ाइल साजिश के माध्यम से सहसंबंध छवि के लिए स्थानिक अंतराल के एक समारोह के रूप में कच्चे सहसंबंध उपाय किया जा सकता है । किसी भी शूंय-अंतराल शोर आगे परिकलन करने से पहले निकाल दिया जाता है, परिणामी के साथ सहसंबंध आयाम (पीक मान, g(0)T) अभिव्यक्ति के साथ पृष्ठभूमि के लिए सही (Eq 3):
जहां मैंबी एक पृष्ठभूमि क्षेत्र से मतलब है तीव्रता कोशिका को छोड़कर । क्लस्टर घनत्व, या फ्लोरोसेंट वस्तुओं के घनत्व, (Eq 4)द्वारा परिभाषित किया गया है:
इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल में, हम आगे बस क्लस्टर घनत्व की गणना (सीडी), अवलोकन के आधार पर धारणा के साथ कि एक सामान्यीकृत सहसंबंध समारोह में वृद्धि के साथ एक १.० आ मूल्य के लिए क्षय होगा स्थानिक अंतराल । अधिकतम स्थानिक अंतराल के साथ, वहां अब प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों के किसी भी संबंध है और इस तरह एक सहसंबंध के बिना इस क्षेत्र में गणना कर रहे है एक तीव्रता इस तीव्रता जो बाद में से विभाजित है द्वारा गुणा के मूल्य कंप्यूटिंग कर रहे है उस तीव्रता का वर्ग है, जो परिभाषा के द्वारा १.० के बराबर है । इस प्रकार, एक सामान्यीकृत सहसंबंध समारोह से क्लस्टर घनत्व सामान्यीकृत से १.० अपने पारस्परिक (Eq 5)लेने से पहले अपने सहसंबंध समारोह से घटाया जा सकता है:
इसके अलावा बीम क्षेत्र के अंशांकन साधन के बिंदु फैले समारोह के क्षेत्र के भीतर निहित समूहों की संख्या quantitate करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है । इस अंशांकन छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के दौरान इस्तेमाल किया एक ही ऑप्टिकल स्थितियों का उपयोग किया जाना चाहिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी की तकनीक (आईसीएस) है कि हम इस प्रोटोकॉल में वर्णन विशेष डिटेक्टरों के लिए की आवश्यकता के बिना मानक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है । आईसीएस तकनीक का इस्तेमाल अच्छी तरह …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक NHMRC (फैलोशिप १०८४१७८ और अनुदान १०८७८५०, १०३०४६९, १०७५८९८ (एम्स)), कैंसर ऑस्ट्रेलिया, लुडविग कैंसर अनुसंधान, जॉन टी रीड ट्रस्ट, इलाज ब्रेन कैंसर फाउंडेशन, ला Trobe विश्वविद्यालय और विक्टोरिया कैंसर एजेंसी से धन समर्थन स्वीकार करते हैं । विक्टोरियन सरकार द्वारा प्रदत्त प्रचालनात्मक अवसंरचना सहायता कार्यक्रम से धन, ऑस्ट्रेलिया को भी स्वीकार किया जाता है.
Materials
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass – 8 well | ThermoFisher Scientific | 155409 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10099141 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 12604021 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11013 | |
| TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Cetuximab | Merck Serono | 3023715501 | |
| Parafilm M 38mx100mm | Merck Millipore | BRND701605 | |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | ProSciTech | C004 | |
| Recombinant Human EGF | R&D System | 236-EG |
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