Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

Summary

바인딩할 대상 수용 체 세포 표면에 항 체 구조와 클러스터링 변경 부여 수 있습니다. 이러한 동적 변경 내용이 대상 셀에 약물 개발 특성화에 대 한 영향을 미칠. 이 프로토콜 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 상호 관계 분광학 ImageJ/피지 수용 체 세포 표면에 클러스터링의 척도를 통해 활용 합니다.

Abstract

Confocal 현미경 검사 법 특성화 및 형광 프로브로 분류 하는 전 임상 에이전트의 추가 개발에 대 한 중요 한 하위 세포 상호 작용을 캡처를 액세스할 수 있는 방법론을 제공 합니다. 기반으로 하는 항 체 세포 독성 약물에 최근 전진으로 전달 시스템, 수용 체 집계 및 국제화의 영역 내에서 이러한 에이전트에 의해 유도 된 변경 이해 중요 한 중요성 이다. 이 프로토콜 활용 하 여 형광 immunocytochemistry의 잘 설립 방법론 및 오픈 소스 피지 분포 ImageJ, inbuilt 상관와 이미지 수학 함수, 공간 이미지 상관 관계를 수행 하 분광학 (IC)입니다. 이 프로토콜은 공초점 현미경의 광선 영역의 기능으로 레이블이 지정 된 수용 체의 형광 강도 quantitates. 이 세포 표면에 대상 분자 집단의 국가의 양적 측정을 제공합니다. 이 방법론은 수용 체 집합의 일시적인 수사로 확장 하는 잠재력을 가진 정적 셀의 특성에 초점. 이 프로토콜은 클러스터링 기술 및 비 전문 이미징 장치 설립 잘 활용 하 여 세포 표면에서 발생 하는 이벤트의 정량화를 제공 하는 접근 방법론을 선물 한다.

Introduction

치료 항 체의 개발에는 여러 종양 종류¹의 치료에서 놀라운 성공을 보이고 있다. 마약 항 체 어원이 같은 말 (ADC)의 최근 발전으로 세포 독성 화합물에 대 한 전달 메커니즘 셀에 항 체: 수용 체 상호 작용의 역동성을 이해 하기 위한 요구 사항을 확대 하고있다²표면. 성공적인 타겟팅 세포 표면 수용 체에 항 체의, 다음이 단지 리간드: 항 체 상호 작용³에서 관찰 된 그 유사 집계 패턴을 유도할 수 있다. 수용 체 집계에서 변경 셀 표면에서 막 하는 수용 체와 그것의 제거의 결과 국제화에 변화를 유도할 수 있다. 항 체 약물 켤레의 맥락에서이 프로세스 이후에 내 면된 endosomes와 이후 효과적인 셀 죽이 결과 세포질 세포 독성 페이로드를 해제 합니다.

Confocal 현미경 검사 법은 항 체와 그들의 대상 수용 체⁴의 이러한 중요 한 상호 작용을 시각화 하는 효과적인 수단을 제공 했다. 집계 대상 분자 세포 표면에서의 변화를 탐험이 프로토콜 활용 공간 이미지 상호 관계 분광학 (IC) 기술 ^{5,6,7 통해 confocal 현미경 이미지의 후 처리} .

이미지 상관 분광학의 기초 공간 형광 강도 변동 관계 레이블이 구조체의 밀도 및 집계 상태를 공유 하는 관찰 이다. 이 관계는 캡처된 이미지⁵의 공간 자기 상관 함수의 계산에 따라 설정 됩니다.

이미지 상관 분광학의 모든 이체는 이미지 상관의 계산이 필요합니다. 이것은이 기능을 양적 집계 상태 매개 변수는 이미지 내에 포함 된의 추출에 대 한 2 차원 가우스 곡선 피팅 옵니다. 간단히에서 이미지 상관의 계산 포함 됩니다 모두 이미지에 포함 된 및 가능성을 계산 가능한 픽셀 쌍을 비교 하는 둘 다 동등 하 게 서로 밝은. 이 거리의 기능과 픽셀 분리⁸방향으로 시각 이다.

이미지 상호 관계 분광학에 대 한 이론적 프레임 워크 그리고 피터슨과 Wiseman 외정의 설립 되었다. ^{5 , 6}.이 프로토콜 상관 계산 피지/ImageJ 스프레드시트 응용 프로그램에서 수행 됩니다, 강도 변동 공간 자기 상관 함수에 대 한 기준 (Eq 1)로 기술 될 수 있다:

     

여기서 F 나타냅니다 푸리에 변환을; F^{− 1} 역 푸리에 변환; F * 복소수; 공간 지연 변수 ε 그리고 η. 공간 IC에서이 프로토콜에서 설명 된 대로 자기 상관 함수 계산할 수는 2D 빠른 푸리에 변환 알고리즘^7,9를 사용 하 여. 0-지연, g₁₁(0, 0)로 그렇지 않으면 알려진 제로 공간 별거에 상관 입자 빔 현미경의 영역 당 현재 역 평균 수를 제공 합니다. 그것은 2 차원 가우스 함수 (Eq 2)공간 자기 상관 함수를 피팅 하 여 얻을 수 있습니다.

     

와 픽셀 이미지 내에서 캡처 영역 설정된에 포함 된 이러한 측정 무한대로 확장 되지 않습니다, 용어 g∞ 이미지 내에 포함 된 장거리 공간적 상관을 오프셋으로 사용 됩니다. 분자 크기의 집계, ω 현미경의 포인트 확산 함수 이며 반-최대 공간 자기 상관 함수에의 전체 폭에 의해 설명. 악기의 확산 기능에 포함 된 지역 하위 해상도 형광 구슬을 사용 하 여 측정 될 수 있다.

여기에 설명 된 이미지 상호 관계 분광학 프로토콜, 상관 및 ICS를 완료 하는 데 필요한 수학 함수는 사용 하 여 수행 오픈 소스 영상 처리 플랫폼, 피지¹⁰는 ImageJ의 분포 프로그램^11,12. 피지/ImageJ FFT 수학 함수에 사전 설치 된 빠른 푸리에 변환을 사용합니다. 이 기능은 각 차원¹³에서 2의 요인에 의해 데이터의 범위를 줄임으로써이 계산의 계산 시간을 줄일 수 있습니다. 2D 자기 상관 함수는 x, y 축에서에서 대략 대칭 상관 이미지를 통해 한 줄 프로필 플롯 원시 자기 상관 공간 지연의 기능으로 측정을 사용할 수 있습니다. 모든 0 지연 잡음 추가 계산을 하기 전에, 결과 상관 진폭 (피크 값, g(0)_T)와 식 (Eq 3)와 함께 배경에 대 한 수정 제거 됩니다.

     

어디 내가_b 셀을 제외 하는 배경 영역에서 평균 강도 이다. 클러스터 밀도, 또는 형광 개체의 밀도 (Eq 4)에 의해 정의 됩니다.

    

여기에 설명 된 프로토콜 우리 가정 접근 공간 지연 증가 함께 1.0 값을 정규화 된 자기 상관 함수 것입니다 붕괴는 관찰을 바탕으로 단순히 클러스터 밀도 (CD)의 계산을 더. 최대 공간 피로 더 이상 어떤 상관 관계가 형광의 강도 값 하 고 따라서 상관 없이이 지역에서 계산 컴퓨팅 나눈 이후에이 강도 곱한 강도 값은 그 강도, 정의 1.0의 광장. 따라서, 클러스터 정규화 된 자기 상관 함수에서 밀도 상호 (Eq 5)을복용 하기 전에 정규화 된 자기 상관 함수에서 1.0을 빼서 계산 될 수 있다:

     

악기의 포인트 확산 함수의 영역 내에 포함 된 클러스터 수를 quantitate 하 빔 영역의 추가 보정을 수행할 수 있습니다. 이 교정은 이미지 상호 관계 분광학 분석 중에 사용 하는 동일한 광학 조건을 사용 하 여 수행 되어야 합니다.

Protocol

1. 부착 셀 라인의 이미징 실험에 대 한 시드 10%를 포함 하는 Dulbecco의 수정이 글 매체/영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12) 미디어의 300 µ L에서 잘 하룻밤 (O/N) 당 10000 A431 해 암 세포를 씨앗 소 태아 혈 청, 1% 페니실린-스와 1%는 8에서 GlutaMAX 이미징 연 발 슬라이드 고해상도 기름 침수 렌즈에 적합 (예를 들어, NuncTM 실험실-TekTM coverglass 연 발). 미디어 실 온 (RT)에서 10 분에 100 ng/mL EGF ligand?…

Representative Results

성공적인 이미지 상호 관계 분광학 실험 치료 컨트롤의 적절 한 응용 프로그램에 따라 달라 집니다. 이러한 치료 그룹 없이 1 차적인 항 체 및 이차 항 체 치료 그룹이 없는 형광의 검사를 포함합니다. 실험에 대 한 최적의 confocal 레이저 설정 설정 되 면 이미지 샘플 내에서 일반적인 형광의 부족을 확인 하이 컨트롤 그룹의 캡처할 수 해야 합니다. 많은 부착 암 세포 라인에…

Discussion

우리가이 프로토콜에서 설명 하는 이미지 상호 관계 분광학 (IC)의 기술 특수 감지기에 대 한 필요 없이 표준 confocal 현미경을 사용 합니다. ICS 기술 설명 잘 설립 immunocytochemistry 메서드 증가 통계 분석에 대 한 여러 치료 조건의 빠른 샘플링을 사용 합니다. 이 방법론 confocal 볼륨, 형광 등을 통해 확산 모바일 분자의 형광 동요의 상관 관계에 따라 대체 단일 분자 기법에 비해 절대 정밀도에 약간의 ?…

Materials

Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass – 8 well	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	ThermoFisher Scientific	12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm	ThermoFisher Scientific	T7279
Cetuximab	Merck Serono	3023715501
Parafilm M 38mx100mm	Merck Millipore	BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	ProSciTech	C004
Recombinant Human EGF	R&D System	236-EG