Microscopia confocale rivela l'aggregazione di recettore di superficie delle cellule tramite spettroscopia di correlazione di immagine

Summary

Gli anticorpi che si legano ai recettori bersaglio sulla superficie delle cellule possono conferire conformazione e alterazioni clustering. Questi cambiamenti dinamici hanno implicazioni per caratterizzare lo sviluppo di farmaci nelle cellule bersaglio. Questo protocollo utilizza la microscopia confocale e spettroscopia di correlazione di immagine attraverso ImageJ/FIJI per quantificare l’entità del recettore sulla superficie cellulare di clustering.

Abstract

Microscopia confocale fornisce una metodologia accessibile per catturare subcellulare interazioni critiche per la caratterizzazione e l’ulteriore sviluppo di pre-clinici agenti etichettati con sonde fluorescenti. Con gli avanzamenti recenti nella droga citotossica anticorpo basato su sistemi di consegna, comprendere le alterazioni indotte da questi agenti all’interno del Regno di aggregazione del recettore e di interiorizzazione è di importanza critica. Questo protocollo sfrutta la metodologia consolidata di immunocytochemistry fluorescente e la distribuzione di FIJI di open source di ImageJ, con la sua autocorrelazione integrato e funzioni matematiche di immagine, per eseguire la correlazione di immagine spaziale spettroscopia (ICS). Questo protocollo quantitates l’intensità di fluorescenza dei recettori con etichettati in funzione della zona di fascio del microscopio confocale. Questo fornisce una misura quantitativa dello stato di aggregazione della molecola bersaglio sulla superficie delle cellule. Questa metodologia è focalizzata sulla caratterizzazione di celle statiche con potenziale di espandersi in indagini temporale dell’aggregazione del recettore. Questo protocollo presenta una metodologia accessibile per fornire quantificazione degli eventi che si verificano alla superficie delle cellule, utilizzando ben stabilito non specializzati imaging apparato e tecniche di clustering.

Introduction

Lo sviluppo di anticorpi terapeutici ha dimostrato notevole successo nel trattamento del tumore più tipi¹. I recenti progressi dei coniugati di anticorpo-farmaco (ADC) come meccanismi di consegna per composti citotossici ha ampliato i requisiti per comprendere le dinamiche delle interazioni anticorpo: recettore dalla cella di superficie². Dopo il successo di targeting di un anticorpo per il recettore di superficie delle cellule, questi complessi possono indurre modelli di aggregazione simili a quelle osservate nel ligando: anticorpo interazioni³. Alterazioni nell’aggregazione del recettore possono indurre cambiamenti alla membrana e risultato nell’internalizzazione del recettore e la sua rimozione dalla superficie delle cellule. Nel contesto di un anticorpo-farmaco coniugato, questo processo rilascia successivamente il payload citotossico in endosomi interiorizzati e, successivamente, il citoplasma, con conseguente uccisione efficace delle cellule.

Microscopia confocale ha fornito un mezzo efficace di visualizzare queste interazioni importanti degli anticorpi e la loro destinazione recettori⁴. Per esplorare i cambiamenti di aggregazione delle molecole alla superficie delle cellule questo protocollo utilizza la post-elaborazione di immagini di microscopia confocale via un immagine spaziale correlazione spettroscopia (ICS) tecnica ^5,6,7 .

La Fondazione di spettroscopia di correlazione di immagine è l’osservazione che le fluttuazioni di intensità di fluorescenza spaziale condividano un rapporto con lo stato di densità e aggregazione delle strutture con etichettate. Questa relazione è stabilita dopo il calcolo di una funzione di autocorrelazione spaziale di un immagine catturata⁵.

Tutte le varianti di spettroscopia di correlazione di immagine richiedono il calcolo di un’immagine di autocorrelazione. Questo è seguito inserendo questa funzione ad una curva gaussiana bidimensionale per l’estrazione dei parametri di stato di aggregazione quantitativi contenuti nell’immagine. In termini semplici il calcolo di un’immagine di autocorrelazione implica il confronto tutte le coppie possibili pixel contenuti all’interno di un’immagine e calcolare la probabilità che sia altrettanto brillante come l’altro. Questo viene visualizzato come una funzione della distanza e direzioni di pixel separazione⁸.

Il quadro teorico per la spettroscopia di correlazione di immagine è stato stabilito e definito da Petersen e Wiseman et al. ^{5 , 6}. nel presente protocollo, vengono eseguiti i calcoli di autocorrelazione in Fiji/ImageJ, nonché un’applicazione di foglio di calcolo, la base per la funzione di autocorrelazione spaziale di intensità fluttuazione può essere descritto come (Eq. 1):

     

dove F rappresenta la trasformata di Fourier; F^{− 1} la trasformata di Fourier trasformazione inversa; F * suo complesso coniugato; e il ritardo spaziale variabili ε e η. In ICS spaziale, come descritto in questo protocollo, la funzione di autocorrelazione può essere calcolata usando un 2D fast Fourier transform algoritmo^7,9. L’autocorrelazione a zero separazione spaziale, altrimenti noto come zero-lag, g₁₁(0,0), fornisce l’inverso numero medio di particelle presenti per area di larghezza del microscopio. Può essere ottenuto inserendo la funzione di autocorrelazione spaziale a una funzione gaussiana bidimensionale (Eq. 2):

     

Come i pixel acquisiti all’interno di un’immagine sono contenuti all’interno di una area set e queste misurazioni non si estendono all’infinito, il g∞ di termine è utilizzato come un offset per tenere conto delle correlazioni spaziali a lungo raggio contenute all’interno dell’immagine. Per gli aggregati di dimensioni molecolari, ω è la funzione di punto di diffusione del microscopio e descritto dalla larghezza piena a metà-al massimo la funzione di autocorrelazione spaziale. L’area contenuta all’interno della funzione di diffusione del punto dello strumento può essere calibrato attraverso l’uso di perline fluorescenti Sub-resolution.

Per protocollo di spettroscopia di correlazione di immagine descritto nel presente documento, l’autocorrelazione e funzioni matematiche necessarie per completare ICS vengono effettuate mediante la piattaforma di imaging-elaborazione di open-source, Fiji¹⁰, una distribuzione del ImageJ programma^11,12. Fiji/ImageJ utilizza la trasformazione di Fourier veloce preinstallata nella funzione FFT matematica. Questa funzione riduce il tempo di calcolo necessario di questo calcolo, riducendo l’intervallo di dati da un fattore di due in ogni dimensione¹³. Come la funzione di autocorrelazione 2D è approssimativamente simmetrica in x, asse y, una singola linea profilo trama attraverso l’immagine di autocorrelazione può essere utilizzata per misurare l’autocorrelazione crudo come una funzione del GAL spaziale. Qualsiasi rumore zero-lag è rimosso prima dell’ulteriore calcolo, con l’ampiezza risultante di autocorrelazione (valore di picco, g(0)_T) corretto per lo sfondo con l’espressione (Eq 3):

     

dove ho_b è l’intensità media da una regione di sfondo esclusa la cella. La densità di cluster, o la densità di oggetti fluorescenti, è definito dal (Eq. 4):

    

Nel protocollo descritto nel presente documento, inoltre semplicemente il calcolo della densità di cluster (CD), con il presupposto basato sull’osservazione che una funzione di autocorrelazione normalizzato decadrà su un valore che si avvicina 1.0 con ritardo spaziale crescente. Con massimo ritardo spaziale, non c’è più alcuna correlazione di fluorescenza i valori di intensità e così senza una correlazione i calcoli in questa regione sono calcolo del valore di intensità moltiplicato questa intensità che viene successivamente diviso per la Piazza di tale intensità, che per definizione è uguale a 1.0. Così, densità di cluster da una funzione di autocorrelazione normalizzato può essere calcolata sottraendo 1.0 dalla funzione di autocorrelazione normalizzato prima della presa del suo reciproco (Eq 5):

     

Ulteriore calibrazione della zona fascio può essere effettuata per quantificare il numero di cluster contenute all’interno dell’area della funzione punto diffusione dello strumento. Questa taratura deve essere eseguita utilizzando le stesse condizioni ottiche utilizzate durante l’analisi di spettroscopia di correlazione immagine.

Protocol

1. semina delle varietà di cellula aderenti per esperimento di Imaging Seme 10.000 cellule di carcinoma epidermoide A431 per ben pernottamento (O/N) a 300 µ l di media per volta Eagle Medium/nutriente miscela F-12 (DMEM/F-12) di Dulbecco contenente 10% di siero fetale bovino, 1% penicillina-streptomicina e l’1% GlutaMAX in un 8 camerato imaging diapositiva adatto per alta risoluzione olio immersione lenti dell’obiettivo (ad es., NuncTM Lab-TekTM camerato coprioggetto). Stimolare l’aggregazi…

Representative Results

Un esperimento di spettroscopia di correlazione immagine di successo dipende dalla corretta applicazione dei controlli di trattamento. Questi gruppi di trattamento comprendono l’esame della fluorescenza in nessun anticorpo primario e i gruppi del trattamento nessun anticorpo secondario. Una volta che le impostazioni ottimali laser confocale sono stabilite per un esperimento, è necessario acquisire immagini di questi gruppi di controllo per confermare l’assenza di fluorescenza non specifi…

Discussion

La tecnica di spettroscopia di correlazione di immagine (ICS) che descriviamo in questo protocollo utilizza microscopi confocali standard senza la necessità di rilevatori specializzati. La tecnica ICS descritta utilizza metodi di immunocitochimica consolidata per fornire per il campionamento rapido di più condizioni di trattamento per l’analisi statistica aumentata. Questa metodologia fa con una leggera riduzione della precisione assoluta rispetto alle tecniche di singola molecola alternativo basato sulla correlazione …

Materials

Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass – 8 well	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	ThermoFisher Scientific	12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm	ThermoFisher Scientific	T7279
Cetuximab	Merck Serono	3023715501
Parafilm M 38mx100mm	Merck Millipore	BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	ProSciTech	C004
Recombinant Human EGF	R&D System	236-EG