Konfokalmikroskopi avslöjar Cell Surface Receptor Aggregation genom bilden korrelation spektroskopi

Summary

Konformation och klustring förändringar kan ge antikroppar som binder till rikta receptorer på cellytan. Dessa dynamiska förändringar påverkar för kännetecknar läkemedelsutveckling i målceller. Detta protokoll använder konfokalmikroskopi och bild korrelation spektroskopi genom ImageJ/FIJI att kvantifiera omfattningen av receptorn klustring på cellytan.

Abstract

Konfokalmikroskopi ger en tillgänglig metod för att fånga sub cellulära interaktioner kritiska för karakterisering och vidareutveckling av prekliniska agenter märkta med fluorescerande sonder. Med senaste framstegen i antikropp baserat cytotoxiska läkemedel är leveranssystem, förstå de förändringar som induceras av dessa agenter inom sfären av receptorn aggregering och internalisering av avgörande betydelse. Detta protokoll utnyttjar den väletablerade metodiken av fluorescerande immuncytokemi och öppen källkod FIJI distribution av ImageJ, med dess inbyggda autokorrelation och bild matematiska funktioner, att utföra rumsliga bilden korrelation spektroskopi (ICS). Detta protokoll quantitates fluorescerande intensiteten av märkt receptorer som en funktion av området balk i mikroskopet confocal. Detta ger ett kvantitativt mått av målet molekyl aggregation på cellytan. Denna metod är inriktad på karakterisering av statiska celler med potential att expandera till temporal utredningar av receptorn aggregation. Detta protokoll presenterar en tillgänglig metod för att tillhandahålla kvantifiering av klustring händelser som inträffar på cellytan, använder väl etablerade tekniker och icke specialiserad bildhantering apparater.

Introduction

Utveckling av terapeutiska antikroppar har visat anmärkningsvärd framgång vid behandling av flera tumör typer¹. De senaste framstegen i antikropp-drogen konjugat (ADC) surface som leveransmekanismer för cytotoxiska substanser har utökat kraven för att förstå dynamiken i antikropp: receptor interaktioner på cellen². Efter framgångsrika målinriktning av en antikropp till cell surface receptorn, kan dessa komplex framkalla liknande aggregering mönster som de som observerades i ligand: antikropp interaktioner³. Förändringar i receptorn aggregation kan framkalla förändringar i membran och resultatet i internalisering av receptorn och dess avlägsnande från cellytan. I samband med ett antikropp-läkemedelskonjugat släpper denna process därefter cytotoxiska nyttolasten i internaliserade endosomes och därefter cytoplasman, vilket resulterar i effektiv cell dödande.

Konfokalmikroskopi har lämnat ett effektivt sätt att visualisera dessa viktiga interaktioner av antikroppar och deras mål receptorer⁴. För att utforska förändringarna om sammanläggning av målmolekyl på cellytan detta protokoll använder tredjeparts efterbearbetning av konfokalmikroskopi bilder via en rumslig bild korrelation spektroskopi (ICS) teknik ^5,6,7 .

Grunden för bilden korrelation spektroskopi är observationen att rumsliga fluorescens intensitet fluktuationer delar en relation till tillståndet densitet och aggregering av de märkta strukturerna. Denna relation upprättas efter beräkningen av en spatial autokorrelation funktion av en tagen bild⁵.

Alla varianter av bilden korrelation spektroskopi kräver beräkning av en bild autokorrelation. Detta följs av passande denna funktion till en tvådimensionell Gaussisk kurva för utvinning av kvantitativa aggregation tillstånd parametrar som ingår i bilden. Enkelt uttryckt innebär beräkning av en bild autokorrelation jämföra alla möjliga pixel paren som ingår i en bild och beräkna sannolikheten att båda lika så ljust som varandra. Detta visualiseras som en funktion av avstånd och riktningar av pixel separation⁸.

Det teoretiska ramverket för den bilden korrelation spektroskopin inrättades och definieras av Petersen och Wiseman et al. ^{5 , 6}. i detta protokoll, autokorrelation beräkningarna utförs i Fiji/ImageJ samt ett kalkylbladsprogram, till grund för funktionen intensitet fluktuation spatial autokorrelation kan beskrivas som (Eq 1):

     

där F representerar fouriertransformen; F⁻¹ inversen Fourier transform; F * dess komplexa konjugatet; och rumsliga eftersläpning variabler ε och η. I rumsliga ICS, som beskrivs i detta protokoll, kan autokorrelation funktion beräknas med hjälp av en 2D fast Fourier transform algoritm^7,9. Autokorrelation på noll rumsliga avskiljandet annars känd som noll-lag, g₁₁(0,0), ger omvänd medeltalet för antalet partiklar per balk av mikroskopet. Det kan erhållas genom att montera funktionen spatial autokorrelation till en tvådimensionell Gaussisk funktion (Eq 2):

     

Som pixlar fångas inom en bild ingår i ett set område och dessa mätningar inte utökar till oändlighet, är den termen g∞ används som en offset för långväga rumsliga korrelationer som finns i bilden. För molekylär och medelstora aggregat, ω funktionen point-spread i mikroskopet och beskrivs av den full bredden på halv-maximum av funktionen spatial autokorrelation. Området som ingår i funktionen punkt spridningen av instrumentet kan kalibreras med hjälp av sub resolution fluorescerande pärlor.

För bild korrelation spektroskopi protokollet beskrivs häri, utförs den autokorrelation och matematiska funktioner som krävs för att slutföra ICS med plattformen med öppen källkod i imaging-bearbetning, Fiji¹⁰, en fördelning av ImageJ program^11,12. Fiji/ImageJ använder tredjeparts förinstallerade snabb Fourier omformningen i funktionen FFT Math. Denna funktion minskar tidsåtgången vid denna beräkning beräkning genom att minska dataområdet med en faktor två i varje dimension¹³. Eftersom funktionen 2D autokorrelation är ungefärligt symmetrisk i x, y-axeln, kan en enda rad profil tomt genom autokorrelation bilden användas att mäta den råa autokorrelation som en funktion av den rumsliga eftersläpningen. Noll-lag buller tas bort före ytterligare beräkning, med resulterande autokorrelation amplituden (toppvärdet, g(0)_T) korrigerat för bakgrund med uttrycket (Eq 3):

     

där jag_b är genomsnittliga intensiteten från en bakgrund regionen exklusive cellen. Den kluster densitet eller täthet av fluorescerande objekt, definieras av (Eq 4):

    

I protokollet beskrivs häri, ytterligare vi helt enkelt beräkningen av klustret densitet (CD), med antagandet baserat på observationen att en normaliserad autokorrelation funktion kommer att förfalla till ett värde som närmar sig 1,0 med ökande rumsliga eftersläpning. Med maximal rumsliga eftersläpning, finns det inte längre någon korrelation mellan fluorescens intensitetsvärdena och således utan en korrelation beräkningarna på denna region computing värdet på en intensitet som multipliceras denna intensitet som divideras därefter med den torget som intensitet, som per definition är lika med 1,0. Klustret densitet från en normaliserad autokorrelation funktion kan således beräknas genom att subtrahera 1.0 från normaliserade autokorrelation funktion innan dess ömsesidiga (Eq 5):

     

Ytterligare kalibrering av området balk kan utföras för att kvantifiera antalet kluster som finns inom området med funktionen punkt spridningen av instrumentet. Denna kalibrering måste utföras med samma optiska villkor används under bilden korrelation spektroskopi analysen.

Protocol

1. seedning av vidhäftande cellinjer för Imaging Experiment Utsäde 10.000 A431 epidermoid karcinom celler per väl övernattning (O/N) i 300 µL av Dulbeccos modifierade Eagle Medium/näringsämne blandning F-12 (DMEM/F-12) media som innehåller 10% fetalt bovint Serum, 1% Penicillin-Streptomycin och 1% GlutaMAX i en 8 kamrar imaging bild lämpar sig för hög upplösning olja nedsänkning objektiv (t.ex. NuncTM Lab-TekTM kamrar täckglas). Stimulera receptorn aggregation på A431 celler m…

Representative Results

En lyckad bild korrelation spektroskopi experiment är beroende av en korrekt tillämpning av behandlingskontroller. Dessa grupper inkluderar undersökning av fluorescensen i ingen primär antikropp och ingen sekundär antikropp behandlingsgrupperna. När de optimala confocal laser inställningarna har gjorts för ett experiment, måste bilder fångas av dessa kontrollgrupper bekräfta avsaknaden av icke-specifika fluorescens i provet. För många vidhäftande cancer cellinjer begränsas …

Discussion

Tekniken med bild korrelation spektroskopi (ICS) som vi beskriver i detta protokoll använder standard confocal Mikroskop utan behov av specialiserade detektorer. Den ICS-teknik som beskrivs utnyttjar väletablerade immuncytokemi metoder att ge för snabb provtagning av flera behandling villkor för ökad statistisk analys. Denna metod gör det med en liten minskning av absolut precision jämfört med alternativa enda molekyl tekniker som bygger på sambandet mellan fluorescens fluktuationer av mobila molekyler sprida ge…

Materials

Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass – 8 well	ThermoFisher Scientific	155409
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	ThermoFisher Scientific	12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µm	ThermoFisher Scientific	T7279
Cetuximab	Merck Serono	3023715501
Parafilm M 38mx100mm	Merck Millipore	BRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	ProSciTech	C004
Recombinant Human EGF	R&D System	236-EG