ठहराव लिपिड बहुतायत और लिपिड वितरण के मूल्यांकन में Caenorhabditis एलिगेंस द्वारा नील लाल और तेल लाल ओ धुंधला
Summary
नील लाल फिक्स्ड Caenorhabditis एलिगेंस के दाग तटस्थ लिपिड जमा की मात्रात्मक माप के लिए एक विधि है, जबकि तेल लाल हे दाग ऊतकों के बीच लिपिड वितरण के गुणात्मक आकलन की सुविधा ।
Abstract
Caenorhabditis एलिगेंस एक असाधारण मॉडल जीव है जिसमें लिपिड चयापचय और ऊर्जा homeostasis का अध्ययन करने के लिए । इसके लिपिड जीन के कई मनुष्यों में संरक्षित कर रहे है और चयापचय सिंड्रोम या अंय रोगों के साथ जुड़े रहे हैं । इस जीव में लिपिड संचय की परीक्षा को निर्धारण रंजक या लेबल मुक्त तरीकों से किया जा सकता है । नील लाल और तेल लाल हे जैसे निर्धारण दाग सस्ती हैं, मात्रात्मक रूप से लिपिड स्तर को मापने के लिए विश्वसनीय तरीके और गुणात्मक ऊतकों में लिपिड वितरण का पालन करने के लिए, क्रमशः । इसके अलावा, इन दाग विभिंन लिपिड चयापचय जीन और रास्ते के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देते हैं । इसके अतिरिक्त, उनके hydrophobic प्रकृति लिपिड घुलनशीलता की सुविधा, आसपास के ऊतकों के साथ बातचीत कम कर देता है, और विलायक में पृथक्करण रोकता है । हालांकि इन तरीकों को सामान्य लिपिड सामग्री की जांच में प्रभावी रहे हैं, वे रासायनिक संरचना और लिपिड जमा की विविधता के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान नहीं करते । इन उद्देश्यों के लिए, जैसे GC-MS और कारों माइक्रोस्कोपी के रूप में लेबल मुक्त तरीकों बेहतर अनुकूल हैं, उनकी लागत के बावजूद ।
Introduction
लिपिड जीवन के लिए आवश्यक हैं । वे झिल्ली के अभिंन घटक हैं, माध्यमिक दूत और संकेत ट्रांसड्यूसर के रूप में कार्य करते हैं, और ऊर्जा भंडारण में महत्वपूर्ण कार्य किया है । जब लिपिड चयापचय dysregulated है, यह मोटापा और प्रकार द्वितीय मधुमेह, जो सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंताओं को दबा रहे हैं जैसे रोगों की ओर जाता है9. Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है जिसमें लिपिड चयापचय का अध्ययन करने के लिए क्योंकि यह एक अपेक्षाकृत कम जीवन चक्र, एक पारदर्शी शरीर, एक ज्ञात कोशिका वंश है, और एक पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम. मुख्य रूप से एक द्विलिंग, सी. एलिगेंस शोधकर्ताओं ने समय की छोटी अवधि में isogenic पशुओं की बड़ी संख्या बढ़ाने के लिए carryout उच्च प्रवाह आगे आनुवंशिक स्क्रीन चयापचय जीन और रास्ते4की एक विस्तृत सरणी का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है । इस दृष्टिकोण से मानव, चूहों, चूहों और drosophila के बीच 273 C. एलिगेंस लिपिड चयापचय जीन में संरक्षण के एक उच्च डिग्री का पता चला है । इसके अलावा, C. एलिगेंस में 300 से अधिक लिपिड जीन मानव orthologues कि चयापचय सिंड्रोम11से असंबंधित रोगों के साथ जुड़े रहे हैं । परंपरागत रूप से, सी. एलिगेंस में लिपिड भंडारण की परीक्षा ज्यादातर डाई पर भरोसा किया है-परख, जो लिपिड संचय के बारे में मजबूत जानकारी प्रदान लेबल । कम आम जहां लिपिड स्थानीयकरण और ऊतकों में लिपिड बहुतायत में अंतर मापा का वर्णन है । हालांकि, हाल ही में काम से पता चला है कि लिपिड वितरण के रूप में लिपिड संचय6के रूप में महत्वपूर्ण हो सकता है ।
हाल ही में, अध्ययनों से उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HPLC-ms), गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-ms), और सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन कैटरिंग (कारें) माइक्रोस्कोपी को संबोधित करने के रूप में तरीकों का घालमेल शुरू कर दिया है सीधे लिपिड निष्कर्षों की सामग्री का विश्लेषण करके दाग आधारित दृष्टिकोण की कमियों, विशिष्ट लिपिड भिन्न, और लिपिड जमा, क्रमशः10,11. इसके अलावा, कार माइक्रोस्कोपी से पता चला है कि नील लाल केवल वसा संचय के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा कर सकते है जब एक निर्धारण डाई के रूप में प्रयोग किया जाता है, एक महत्वपूर्ण दाग के रूप में इसके उपयोग के लिए रवाना ऑटो-फ्लोरोसेंट organelles10के धुंधला लक्ष्य की ओर जाता है । तथापि, आवश्यक तकनीकी विशेषज्ञता और इन क्रोमैटोग्राफी और सूक्ष्म तरीकों के साथ जुड़े लागत कई अनुसंधान सवालों के लिए उनके उपयोग अस्थिर बनाते हैं । इस अनुच्छेद में, हम एक सुविधाजनक और विश्वसनीय विधि को निर्धारित करने और C. एलिगेंस में तटस्थ लिपिड जमा दाग नील लाल और तेल लाल हे का उपयोग करने के लिए पूरे पशुओं में और विशिष्ट ऊतकों में लिपिड बहुतायत भेद चर्चा ।
नील लाल, 9-diethylamino-5H-benzo [α] phenoxazine-5-एक, एक benzophenoxazone डाई है कि आसानी से विभिंन कार्बनिक सॉल्वैंट्स में घुल, लेकिन पानी में ज्यादातर अघुलनशील है । यह एक उत्कृष्ट lysochrome जैसे ट्राइग्लिसराइड्स या कोलेस्ट्रॉल एस्टर के रूप में तटस्थ लिपिड दाग इस्तेमाल किया डाई है, क्योंकि यह एक मजबूत रंग सुविधाओं, लिपिड में अच्छी तरह से solubilizes, आसपास के ऊतकों के साथ नगण्य बातचीत है, और में से विलायक में कम घुलनशील है रक्तदाब. यह एक उत्तेजना और 450-500 और 520 एनएम के उत्सर्जन maxima, क्रमशः1है । जब नील लाल दाग सी. एलिगेंस हरे प्रतिदीप्ति के लिए देखा जाता है, असतत लिपिड निकायों आंत और अन्य ऊतकों में या तो समूहों में मनाया जा सकता है या समान रूप से फैलाया, जानवर के जीनोटाइप या प्रयोगात्मक उपचार पर निर्भर करता है 7.
तेल लाल हे एक lysochrome, वसा में घुलनशील डाई ट्राइग्लिसराइड्स और लिपो दाग के लिए इस्तेमाल किया है । इसे एक डाइज डाई कहा जाता है क्योंकि इसकी रासायनिक संरचना में तीन खुशबूदार छल्ले से जुड़ी दो डाइज समूह होती हैं. यह मुश्किल है, जो renders यह अत्यधिक लिपिड में घुलनशील । इसका दाग रंग लाल है और इसका प्रकाश अवशोषण अधिकतम 518 एनएम 3है । C. एलिगेंस तेल लाल ओ शो लाल लिपिड बूंदों है कि पशु पारदर्शी शरीर है, जो विभिंन ऊतकों के बीच लिपिड वितरण के गुणात्मक मूल्यांकन की सुविधा के खिलाफ बाहर खड़े6के साथ दाग ।
Protocol
Representative Results
Discussion
मोटापा और चयापचय रोग दर में वृद्धि सी. एलिगेंस एक उपयुक्त मॉडल है कि कोशिकाओं और ऊतकों में वसा संचय को विनियमित तंत्र का अध्ययन करने के लिए बनाता है । हाल के सबूत से पता चलता है कि लिपिड स्तर में परिवर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH ग्रांट द्वारा ही संभव किया गया था: R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
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