Количественное определение липидного изобилия и оценки распределения липидов в Caenorhabditis elegans Нила красный и нефти красный O пятнать
Summary
Нил красное окрашивание фиксированной Caenorhabditis elegans — это метод для количественного измерения нейтральных липидных отложений, в то время как нефть красный O пятнать способствует качественной оценки липидного распределения среди тканей.
Abstract
Caenorhabditis elegans является организма исключительные модели для изучения метаболизма липидов и энергетического гомеостаза. Многие из его гены липидного сохраняются в организме человека и связаны с метаболическим синдромом или других заболеваний. Экспертиза накопления липидов в этот организм может осуществляться фиксирующие красителей или метки бесплатные методы. Фиксаторные пятна, как Нил красный и масло красный O недорогой, надежный способов количественно измерить уровень липидов и соблюдать качественно распределение липидов в тканях, соответственно. Кроме того эти пятна позволяют для высокопроизводительного скрининга различных генов метаболизма липидов и пути. Кроме того их гидрофобная природа облегчает растворимости в липидах, уменьшает взаимодействие с окружающих тканей и предотвращает диссоциации в растворитель. Хотя эти методы эффективны при рассмотрении содержания общих липидов, они не предоставляют подробную информацию о химическом составе и разнообразия липидных отложений. Для этих целей, лейбл бесплатные методы, такие как GC-MS и автомобили микроскопии лучше подходит, их расходы, несмотря на.
Introduction
Липиды являются необходимым для жизни. Они являются неотъемлемыми компонентами мембран, выступать в качестве вторичного посыльных и сигналов датчиков и имеют важные функции в хранения энергии. Когда метаболизма липидов является dysregulated, это приводит к заболеваний, как ожирение и диабет типа II, которые насущных проблем общественного здравоохранения9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) представляет собой отличную модель организм для изучения метаболизма липидов, потому что он имеет относительно короткий жизненный цикл, прозрачное тело, известный клеток линии и полностью виртуализированного генома. Главным образом гермафродита, C. elegans позволяет исследователям привлечь большое количество isogenic животных в короткие периоды времени выполнять вперед генетических экраны высокой пропускной способностью для изучения широкий спектр метаболических генов и пути4. Этот подход показал высокую степень сохранения в 273 генов метаболизма липидов C. elegans среди людей, мышей, крыс и дрозофилы. Кроме того более 300 липидов генов у нематоды Caenorhabditis elegans у человека orthologues, которые связаны с заболеваниями, не связанные с метаболическим синдромом11. Традиционно изучение хранения липидов в C. elegans основном опирался на краситель меченых анализов, которые предоставляют надежную информацию о накопление липидов. Реже представляет собой описание где локализовать липиды и измеренных различия в изобилии липидов в тканях. Однако последние работы показал, что распределение липидов может быть также важно, как накопление липидов6.
В последнее время, исследования начали интеграции методы, такие как высокая производительность жидкого хроматография масс-спектрометрия (ВЭЖХ-МС), газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ-МС), и последовательной анти Стокса микроскопия комбинационного рассеяния (легковые автомобили) адрес недостатки подходов, основанных на пятно, анализируя содержание липидов экстрактов, конкретных Липидные фракции и липидных отложений, соответственно10,11непосредственно. Кроме того автомобили микроскопия показала, что Нил красный может служить лишь в качестве прокси для накопление жира при использовании в качестве фиксирующие краска, для его использования как пятно жизненно приводит к пятнать пробить авто люминесцентные органеллы10. Однако необходимых технических специалистов и расходы, связанные с этими хроматографии и методы микроскопии делают их использования неприемлемой для многих исследований вопросов. В этой статье мы обсудим удобный и надежный способ фиксировать и выведение липидный нейтральными вкладов в C. elegans с помощью Нил красный и масло красный O различать изобилие липидов в целом животных и в определенных тканях.
Нил красный, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, является benzophenoxazone краска, которая легко растворяется в различных органических растворителей, но в основном нерастворимые в воде. Это отличный lysochrome краска используется для пятно нейтральные липиды как триглицеридов или эфиры холестерина потому, что он имеет сильный цвет, solubilizes хорошо в липиды, имеет незначительное взаимодействие с окружающими тканями и менее растворим в растворитель чем в липиды. Он имеет возбуждения и выбросов Максима 450-500 и 520 Нм, соответственно1. При просмотре Нила красно окрашенных C. elegans для зеленой флуоресценцией дискретных липидов органов может быть наблюдается на протяжении кишечника и других тканях либо в кластеры или равномерно рассеяны, в зависимости от генотипа животного или экспериментальное лечение 7.
O нефти красный является lysochrome, жирорастворимых краситель, используемый для пятно триглицеридов и липопротеидов. Это называется azo краситель, потому что его химическая структура содержит две группы АЗО, придает трех ароматических колец. Это трудно ионизируется, который оказывает растворяется в липидах. Его пятно цвета красный и его максимального поглощения света — 518 Нм 3. C. elegans витражи с маслом, красный O показывают красный липидного капель, которые стоят вне против прозрачное тело животного, которое способствует качественной оценки липидного распределения среди различных тканей6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рост ожирения и метаболических заболеваний ставки делает C. elegans подходящую модель для изучения механизмов, которые регулируют накопление жира в клетках и тканях. Последние данные свидетельствуют о том, что изменения в уровне липидов коррелируют с клеточных процессов, начиная от и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа стала возможной благодаря гранта NIH: R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).
- Horobin, R. W., Kiernan, J. A. . Conn’s biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , (2002).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).
- Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).
- Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
- Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).
- Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
- Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5 (9), e12810 (2010).
- Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
- O’Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).
