כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O
Summary
הנילוס אדום צביעה של קבוע Caenorhabditis elegans הוא שיטה למדידה כמותית של משקעי השומנים נייטרלי, בעוד שמן אדום O צביעת מקלה על הערכה איכותית של השומנים התפלגות בין רקמות.
Abstract
Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל יוצא דופן שבו ללמוד השומנים ומטבוליזם אנרגיה הומאוסטזיס. רבים מבין הגנים השומנים שלו נשמרים אצל בני אדם, קשורים עם תסמונת מטבולית או מחלות אחרות. בחינה של הצטברות השומנים בתוך האורגניזם יכול להתבצע על ידי צבעי לשבועיים או שיטות ללא תווית. מקבע כתמים כמו הנילוס אדום, שמן אדום O דרכים זול, אמין למדוד באופן כמותי את רמות השומנים בדם, איכותית. מהניסוי לצפות השומנים הפצה ברחבי רקמות, בהתאמה. יתר על כן, הכתמים האלה מאפשרות תפוקה גבוהה הקרנת גנים מטבוליזם השומנים מסלולים שונים. בנוסף, הידרופוביות טבען מקלה על מסיסות השומנים, מפחית את האינטראקציה עם הרקמות הסובבות, ומונעת דיסוציאציה לתוך הממס. למרות ששיטות אלה יעילים בחינת תוכן שומני כללי, הם לא מספקים מידע מפורט אודות ההרכב הכימי ואת הרב-גוניות של משקעי השומנים. עבור מטרות אלה, ללא תווית שיטות כמו מיקרוסקופ GC-MS ומכוניות הם יותר מתאימים, שלהם עולה על אף האמור.
Introduction
שומנים חיוניים לחיים. הם חלק בלתי נפרד מרכיבי ממברנות, לשמש שליחים משניים, אות מתמרים, ויש פונקציות מכריע באחסון אנרגיה. כאשר מטבולי dysregulated, זה מוביל מחלות כמו השמנת יתר, סוכרת סוג II, אשר לוחץ על בריאות הציבור חששות9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא אורגניזם מודל מצוין שבו ללמוד מטבולי כי יש מחזור חיים קצר יחסית, גוף שקוף, שושלת תא ידוע ו גנום מלא ברצף. בעיקר אנדרוגינוס, C. elegans מאפשר לחוקרים להעלות מספר גדול של חיות isogenic בקיצור פרקי זמן למסכים carryout תפוקה גבוהה העברה גנטית ללמוד מגוון רחב של גנים מסלולים מטבוליים4. גישה זו חשפה רמה גבוהה של שימור גנים מטבוליזם השומנים של C. elegans 273 בין בני אדם, עכברים, חולדות, דרוזופילה. יתר על כן, הגנים השומנים מעל 300 C . elegans יש orthologues האנושי המשויכות עם מחלות שאינן קשורות תסמונת מטבולית11. באופן מסורתי, בחינת השומנים אחסון C . elegans הסתמכה בעיקר על מבחני התווית על-ידי צבע, המספקות מידע חזקה על הצטברות שומנים בדם. פחות נפוץ הוא תיאור של איפה לשפה ליפידים ההבדלים נמדד בשפע השומנים מעבר רקמות. עם זאת, העבודה האחרונה חשף כי השומנים הפצה יכול להיות חשוב כמו הצטברות השומנים6.
לאחרונה, מחקרים החלו שילוב שיטות כמו ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה מסות (HPLC-MS), גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS), ולא קוהרנטי אנטי-סטוקס ראמאן מיקרוסקופ פיזור (מכוניות) לכתובת החסרונות של גישות כתם על-ידי ישירות ניתוח התוכן של השומנים תמציות השומנים ספציפי שברים, השומנים פיקדונות, בהתאמה10,11. יתר על כן, מיקרוסקופיה מכוניות חשף כי הנילוס אדום יכול לשמש רק proxy עבור הצטברות שומן כאשר הוא משמש צבע מקבע, עבור השימוש כמו כתם חיוני שמוביל רחוק ממסלול הנחיתה-צביעת של auto-פלורסנט organelles10. עם זאת, נדרשת מומחיות טכנית של עלויות המשויכות גזים אלה ולעשות מיקרוסקופ שיטות השימוש שלהם רופף עבור שאלות מחקר רבות. במאמר זה נדון שיטה נוח ואמין שמלמדות, כתם משקעי השומנים נייטרלי C. elegans באמצעות הנילוס אדום, שמן אדום O להבחין שפע השומנים בבעלי חיים שלם, ברקמות מסוימות.
הנילוס אדום, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, הוא צבע benzophenoxazone ברצון מתמוסס בממיסים אורגניים שונים, אך בעיקר הוא מסיס במים. . זה צבע lysochrome מעולה נהגה כתם נייטרלי שומנים כגון טריגליצרידים או האסטרים כולסטרול כי הוא כולל צבע חזק, solubilizes גם שומנים, יש זניח אינטראקציה עם הרקמות הסובבות, והוא פחות מסיס הממס יותר ב שומנים. יש של maxima עירור, פליטה של 450-500 ו 520 ננומטר, בהתאמה1. כאשר הנילוס C. elegans המוכתמות באדום מוצג עבור קרינה פלואורסצנטית ירוק, גופים השומנים דיסקרטית ניתן נצפתה לאורך כל המעי לרקמות אחרות או אשכולות בתוך או באופן שווה התפזרו, בהתאם של החיה גנוטיפ או טיפול ניסיוני 7.
שמן אדום O היא lysochrome, צבע מסיס בשומן נהגה כתם lipoproteins טריגליצרידים. זה נקרא של צבע אזו כי המבנה הכימי שלו מכיל שתי קבוצות אזו המצורפת שלוש טבעות ארומטיות. זה קשה ionize, אשר הופך את מסיס מאוד שומנים. צבעה כתם אדום והוא קליטת האור שלה המרבי 518 nm 3. C. elegans מוכתם עם שמן אדום O להראות טיפות השומנים אדום אשר בולטות נגד גוף שקוף החיה, אשר מקלה על הערכה איכותית של השומנים התפלגות בין רקמות שונות6.
Protocol
Representative Results
Discussion
עליית השמנת יתר, מחלות מטבוליות המחירים גורם C. elegans מודל מתאים ללמוד את המנגנונים המווסתים הצטברות שומן ב תאים ורקמות. ממצאים אחרונים מעידים כי השינויים ברמות השומנים נמצאים בקורלציה עם תהליכים תאיים החל אינסולין איתות8, ההפעלה של הורמון קולטנים2, פלט הרבייה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו התאפשרה על ידי המענק-NIH: R01GM109028 (S.P.C.)
Materials
| Imager.M2m Microscope | Zeiss | n/a | Fluorescence microscope |
| ERC5s camera | Axiocam | n/a | Color-capable |
| MRm camera | Axiocam | n/a | Fluorescence-capable |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | Lipid Stain |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | Lipid Stain |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA stain |
| Isopropyl Alcohol | BDH | BDH1133-1LP | Fixative solution |
| 0.2 µm seterile syringe filter | VWR | 28145-477 | Cellulose acetate filter |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | Centrifuge |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | Shaker |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | Rotator |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| Peptone | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| Agar | Teknova | L9110 | NGM |
| LB media | Sigma-Aldrich | L3147 | Bacterial growth |
References
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100 (3), 965-973 (1985).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122 (6), 749-752 (2009).
- Horobin, R. W., Kiernan, J. A. . Conn’s biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. , (2002).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9 (6), 2180-2191 (2014).
- Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112 (50), 15378-15383 (2015).
- Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
- Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414 (6865), 799-806 (2001).
- Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
- Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5 (9), e12810 (2010).
- Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14 (1), 164 (2013).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
- O’Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10 (5), 430-435 (2009).
